Bindung von MARCKS an anionische Phospholipidvesikel, Aggregations- und Transportverhalten von synthetischen Gentransfer-Komplexen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit
Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) zum ersten Mal
systematisch die Bindung von fluoreszenzmarkierten Peptiden an
anionischen Lipidmembranen untersucht. Mit dieser Methode konnten
Einzelmolekül-Messungen zur Bindung von myristoyliertem
Alanin-reichen C Kinase Substrat, MARCKS (151-175), an unilamellare
Vesikel mit einem Durchmesser von 100 nm durchgeführt werden. Die
Vesikel bestanden aus dem neutralen Lipid Phosphatidylcholine (PC)
und den negativ geladenen Lipiden Phosphatidylserine (PS) oder
Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Eine
Signal/Rausch-Analyse ermöglichte die Bestimmung der Sensitivität
und des linearen Messbereichs der Methode. Auf Grund der
unterschiedlichen Korrelationszeiten der freien und gebundenen
Peptide folgte aus den gemessenen Autokorrelationskurven der
prozentuale Anteil des gebundenen Pepids. Die Bindung von
MARCKS(151-175) an die anionischen Vesikel wurde für verschiedene
prozentuale Anteile von PS und PIP2 gemessen. Sie war umso stärker,
je höher der Anteil anionischer Lipide in der Membran und damit die
attraktive elekrostatische Wechselwirkung war. Die ermittelten
Bindungskonstanten stimmten gut mit den Resultaten überein, die mit
etablierten konventionellen Techniken wie NMR, ITC oder
Spinmarkierung gewonnen wurden. Die Experimente konnten zeigen,
dass mit FCS direkte Messungen von nanomolaren
Peptidkonzentrationen möglich sind. FCS stellt eine präzise Methode
zur Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden und Proteinen mit
Lipidmembranen dar. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die
Selbstorganisation und das Aggregationsverhalten von verschiedenen
synthetischen Gentransfer-Komplexen studiert. Mit der Methode der
quantitativen Fluoreszenzmikroskopie wurde die Größenverteilung
bestimmt und die Zahl der Plasmide pro Gentransfer-Komplex
berechnet. Die Polyplexe stellen im Unterschied zu den Lipoplexen
unter den experimentellen Bedingungen ein polydisperses kolloidales
System dar. Unter dem Einfluss eines natürlichen Surfactants
(Alveofact) war ein umgekehrtes Verhalten zu beobachten. Die
Messungen zur Kinetik des kolloidalen Systems erfolgten mit der
Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie. Mit dieser Methode wurde der
Einfluss der Ionenkonzentration und von Alveofact auf die
Aggregationskinetik von verschiedenen positiv geladenen
Gentransfer-Komplexen untersucht. Die Experimente zeigten, dass die
Geschwindigkeit der kolloidalen Aggregation mit der
Ionenkonzentration drastisch zunimmt und die mittlere Zahl der
Plasmide pro Komplex als Funktion der Zeit linear ansteigt. Nach
der Inkubation mit Alveofact stellten die Polyplexe auch unter
physiologischen Bedingungen ein stabiles kolloidales System dar und
bestanden im Mittel aus 3-5 Plasmiden. Auch in diesem Fall wurde
bei den DNA/Lipofectamine-Komplexen ein anderes
Aggregationsverhalten beobachtet. Sie bildeten ohne die Einwirkung
von Alveofact unabhängig von der Ionenkonzentration ein stabiles
Kolloid und bestanden im Mittel aus nur zwei kondensierten
Plasmiden. Dagegen führte die Inkubation mit Alveofact zu einer
langsamen kolloidalen Aggregation. Die Lipoplexe erreichten in
diesem Fall nach 60 min eine Größe von ~3-4 Plasmiden pro Komplex.
Mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie wurde das
Transportverhalten verschiedener Vesikel und Gentransfer-Komplexe
in einem negativ geladenen Polymer-Netzwerk (Mucin) untersucht. Die
Größe und die Ladung der Partikel bestimmten die Diffusion durch
das Polymer-Netzwerk. Kleinere Durchmesser und höhere negative
Ladungen der Vesikel trugen zu einem effektiveren Transport durch
das Netzwerk bei. Aus der Diffusionskonstante und der
makroskopischen Viskosität der Polymerlösung wurden die
Abweichungen von der Stokes-Einstein-Relation berechnet. Das
Diffusionsverhalten anionischer Vesikel wurde zum Vergleich auch in
einem positiv geladenen Kollagen-Netzwerk studiert. Bei den
synthetischen Gentransfer-Komplexen mit positiver Überschussladung
wurde auf Grund der Bindung zum Netzwerk ein deutlicher Abfall der
Diffusionskonstante als Funktion der Polymer-Konzentration
beobachtet. Im Unterschied dazu zeichneten sich die negativ
geladenen Komplexe wegen der repulsiven elektrostatischen
Wechselwirkung durch einen effektiveren Transport im Mucin-Netzwerk
aus. Unter dem Einfluss von Alveofact zeigten die positiv geladenen
Komplexe ein ähnliches Transportverhalten wie die negativ geladenen
Komplexe. Eine gezielte Beschichtung der Komplexe ermöglichte also
einen verbesserten Transport durch das Polymer-Netzwerk, was im
Zusammenhang mit einem effizienten Gentransfer von Interesse ist.