Optimierung einer Methode zum Nachweis von p53-Mutationen in der Kolonlavage bei kolorektalen Neoplasien

Das kolorektale Karzinom ist die zweithäufigste Todesursache durch
maligne Tumoren in den Industrienationen, verantwortlich für mehr
als 10 % aller Krebstoten, mit zunehmender Inzidenz. Eine Heilung
verspricht nur die chirurgische Intervention im Frühstadium, die
Prognose in fortgeschrittenen Krankheitsstadien ist meist schlecht.
Die Entdeckung der genetischen Veränderungen während der
Tumorgenese kolorektaler Tumoren lässt hoffen, dass eine
Früherkennung dieser ernsten Erkrankung über den Nachweis
bestimmter Genmutationen im Stuhl oder der Kolonlavageflüssigkeit
möglich ist. Die dabei am häufigsten auftretenden Mutationen
betreffen das p53-Tumorsuppressorgen. Ziel dieser Arbeit war die
Optimierung einer Methode zum Nachweis von p53 Mutationen in
Kolonlavageproben. Mit Hilfe einer „Single Strand Conformation
Polymorphism“ – Analyse war ein einfaches Screening der Exons 5-8
des p53-Gens möglich. Für die Etablierung dieser SSCP-Analyse und
als positiv Kontrolle dienten die Zelllinien SW480, HaCat, Kle-1B,
Hec-1B, Hut 78 und BT-20. Alle Mutationen der Zelllinien ließen
sich in der optimierten SSCP-Analyse zweifelsfrei nachweisen. Dabei
konnte bezüglich der Sensitivität dieser Methode gezeigt werden,
dass ein Anteil von ≥ 20 % mutierter DNA in der Wildtyp-DNA nötig
ist, um die Mutation nachzuweisen. Bei 37 Patienten mit
kolorektalem Karzinom und einem Patienten mit einem 3 cm großen
kolorektalen Adenom wurde eine Koloskopie durchgeführt. Die Tumoren
wurden histopathologisch klassifiziert und die Lavageflüssigkeit
zur weiteren Analyse gesammelt. Nach der Extraktion der DNA aus den
Lavageproben folgten PCR und Reinigung der Amplifikate. Sowohl die
Extraktion der DNA als auch die Amplifikation konnte in allen
Fällen problemlos durchgeführt werden. P53 Mutationen konnten mit
Hilfe der SSCP-Analyse bei 8 (22 %) der Karzinompatienten und bei
dem Adenompatienten (100 %) detektiert werden. Es zeigte sich keine
Korrelation zwischen dem Tumorstadium und dem Mutationsnachweis.
Weiter zeigte sich keine Korrelation zwischen zusätzlich zu den
Karzinomen vorhandenen Adenomen und dem Mutationsnachweis. Mit der
hier verwendeten Methode ist ein Nachweis von p53 Mutationen in
Kolonlavageproben möglich. Es konnten Mutationen sowohl in einem
prämalignen Stadium als auch bei kleinen, auf Mukosa und Submukosa
beschränkten, Karzinomen nachgewiesen werden. Der Mutationsnachweis
gelang bei Tumoren aus allen Kolonabschnitten. Dennoch ist die
Sensitivität der hier vorgestellten Methode zum gegenwärtigen
Zeitpunkt nicht ausreichend. Weitere Studien werden benötigt, um
die Sensitivität beispielsweise durch DNA-Anreicherungsmethoden zu
erhöhen.