Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe bei Arcanobacterium pyogenes: Etablierung und Anwendung der Empfindlichkeitsbestimmung mittels Bouillonmikrodilution sowie genotypische Charakterisierung tetracyclinresistenter Stämme

Stämme der Spezies Arcanobacterium (A.) pyogenes gelten allgemein
als empfindlich gegenüber Penicillinen. Hauptsächlich aus diesem
Grund gibt es bisher keine etablierte Methode zur
Empfindlichkeitsbestimmung von A. pyogenes. Im Rahmen dieser Arbeit
wurde für A. pyogenes eine Methode zur Bestimmung der Minimalen
Hemmkonzentration (MHK) mittels Bouillonmikrodilution erarbeitet,
die sich an der Vorgehensweise des CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute, USA)-Dokumentes M31-A2 orientiert. Mit Hilfe
der erarbeiteten Methode wurden die MHK-Werte zweier
Bakterienkollektive mit insgesamt 115 Bakterienstämmen [53
süddeutsche Isolate sowie 62 deutschlandweit im Rahmen eines
Monitoringprogramms (Bft-GermVet) gesammelte Stämme] bestimmt.
Zusätzlich wurde die genetische Grundlage der dabei häufig zu
beobachtenden Tetracyclinresistenz untersucht. Bei Anwendung der
vom CLSI-Dokument empfohlenen Verdünnung der Bakteriensuspension im
Medium im Verhältnis 1:200 wurde die Inokulumsdichte von A.
pyogenes im Vergleich zum vorgeschriebenen Dichtebereich etwa um
das Dreifache über-schritten. Daher wurde eine Verdünnung im
Verhältnis 1:667 vorgenommen, wodurch valide Inokulumsdichten
erreicht wurden. In der vom CLSI-Dokument empfohlenen
kationenadjustierten Müller-Hinton-Bouillon (CaMHB) konnte ohne
weitere Zusätze kein ausreichendes Bakterienwachstum erreicht
werden, unter Zusatz von 2 % fetalem Käl-berserum (FKS; aufgrund
des Vorhandenseins von Thymidin nur für die Testung
nicht-sulfonamidhaltiger Antibiotika verwendbar) oder 2 % lysiertem
Pferdeblut konnte die MHK nach 24 Stunden gut abgelesen werden.
Aerob (von der CLSI-Norm empfohlen) und unter Zusatz von 3 Vol% CO2
bebrütete Mikrotiterplatten wiesen nach 24 Stunden keine relevanten
Unterschiede in der MHK der untersuchten Wirkstoffe auf. Aufgrund
der besseren Ablesbarkeit wurde der Inkubation unter Zusatz von CO2
der Vorzug gegeben. Die aus dem süddeutschen Raum stammenden A.
pyogenes-Stämme wurden hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber
Tetracyclin, Penicillin G und Erythromycin untersucht. Im Rahmen
des BfT-GermVet-Projekts wurden die Isolate auf ihre
Empfindlichkeit gegenüber 24 verschiedenen Wirkstoffen geprüft.
Eine qualitative Bewertung als „resistent“ oder „sensibel“ konnte
anhand der im Dokument M31-A2 vorhandenen Grenzwerte nur für wenige
Wirkstoffe (Amoxicillin/Clavulansäure, Cephalothin, Tetracyclin,
Chloramphenicol, Sulfa-methoxazol/Trimethoprim, Sulfamethoxazol;
Ampicillin und Penicillin unter Vorbehalt) vorgenommen werden.
Gegenüber den getesteten β-Lactam-Antibiotika, Aminoglykosiden,
Fluorchinolonen und Phenicolen wurden generell niedrige MHK-Werte
beobachtet, die - soweit Grenzwerte vorhanden waren - im sensiblen
Bereich lagen. Bei der Testung von Sulfonamiden und potenzierten
Sulfonamiden kam es zu großen Unterschieden zu früheren Studien,
was jedoch eher auf methodische Unterschiede zurückzuführen ist als
auf Änderungen der Resistenzraten. Gegenüber
Sulfamethoxazol/Trimethoprim waren alle Stämme empfindlich,
gegenüber Sulfamethoxazol waren die porcinen Isolate ebenfalls
empfindlich, die bovinen Stämme wiesen je nach Indikation eine
Resistenzrate von 24 bis 32 % auf. Insgesamt waren 9,5 % der
untersuchten Isolate resistenzverdächtig gegenüber
Makrolid-Antibiotika. Diese im Vergleich zur Literatur niedrige
Zahl ist entweder durch die unterschiedlichen Isolatzahlen bedingt
oder tatsächlicher Ausdruck eines Resistenzrückgangs, der mit dem
Verbot von Tylosin als Futtermittelzusatzstoff in den 1990er Jahren
assoziiert sein könnte. Bei der Untersuchung von Tetracyclin
erwiesen sich unabhängig von der Tierart über 60 % der Isolate als
resistenzverdächtig, wobei die MHK90 beim Schwein bei 8 µg/ml und
beim Rind bei 64 µg/ml lag. Bei der genetischen Untersuchung von 36
tetracyclinresistenten Isolaten aus Süddeutschland auf das
Vorkommen von acht verschiedenen tetracyclinresistenzvermittelnden
Genen konnte bei 66,7 % der Isolate das für ein ribosomales
Schutzprotein kodierende Resistenzgen tet(W) detektiert werden, das
in der Literatur als hauptverantwortlich für die
Tetracyclinresistenz bei A. pyogenes gilt. Neben diesem konnte auch
die strukturelle Einheit eines für ein Effluxprotein kodierenden
Gens, tet(33), bei 22,2 % der Isolate nachgewiesen werden. Bei
keinem Stamm konnte tet(33) ohne gleichzeitig vorhandenes tet(W)
isoliert werden. Die in der Literatur beschriebene Lokalisation von
tet(33) auf einem Plasmid konnte für die untersuchten Stämme nicht
bestätigt werden. Bei allen tet(W)- und tet(33)-positiven Isolaten
handelte es sich um Stämme boviner Herkunft. Der MHK-Wert der
tet(W)-positiven Isolate lag zwischen 8 und 64 µg/ml, die Mehrheit
der Stämme hatte eine MHK von 16 µg/ml. In Anwesenheit von tet(33)
lag die MHK bei sieben von acht Isolaten bei 32 µg/ml, ein Isolat
wies eine MHK von 64 µg/ml auf. Bei einem Isolat boviner Herkunft
(4371-03), bei dem weder tet(W) noch tet(33) detektiert werden
konnte, konnte erstmals für Arcanobakterien die regulatorische
Einheit des Gens tet(Z), das bisher nur bei Corynebacterium
glutamicum beschrieben wurde, identifiziert werden. Das Strukturgen
tetA(Z), das ebenfalls für ein Effluxprotein kodiert, konnte nur
partiell nachgewiesen werden. Es ist daher nicht bekannt, ob die
bei 4371-03 beobachtete MHK von 8 µg/ml auf das identifizierte
tet(Z) zurückzuführen ist. Insgesamt blieben elf Isolate
einschließlich aller Stämme porciner Herkunft (N = 8) ohne
zugeordnete tet-Determinante.