Entwicklung von sensitiven Nachweismethoden für canines HMGB1 und TNFα zur Untersuchung der Rolle dieser Faktoren bei der Sepsis

Trotz des Einsatzes verschiedenster sehr potenter Antibiotika und
Antiphlogistika in Verbindung mit einer ausgereiften
Intensivmedizinischen Betreuung ist die Sepsis sowohl in der Human-
als auch in der Tiermedizin heute immer noch eine der häufigsten
Todesursachen. Die Immunpathogenese der Erkrankung ist
gekennzeichnet durch eine systemische Entzündungsreaktion,
hervorgerufen durch eine frühe Sekretion des Zytokins Tumor Nekrose
Faktor alpha (TNFα). Im Vergleich zu TNFα gilt dagegen das erst
kürzlich entdeckte Zytokin High Mobility Group Box 1 (HMGB1) als
später proinflammatorischer Faktor. Um nun die Rolle dieser beiden
Zytokine in der caninen Sepsis näher zu untersuchen, wurden neue
sensitive Nachweismethoden etabliert und zusätzlich zwei bereits
kommerziell erhältliche Substanzen aus der Humanmedizin zur
Neutralisation von caninem TNFα in vitro getestet. Anhand bereits
publizierter Sequenzen und mit Hilfe der Ensembl Datenbank konnten
per PCR die Sequenzen für canines TNFα, TNFR1 (P60), HMGB1 und
dessen Rezeptor RAGE kloniert und die Proteine rekombinant
exprimiert werden. Die Bioaktivität und die Konzentration des
rcanTNFα wurden in einem Zytotoxizitäts Assay mit der Zelllinie
WEHI164 getestet. Die Bioaktivität des P60-Fc Fusionsproteins wurde
durch seine neutralisierende Wirkung auf das zytotoxische rcanTNFα
im gleichen Assay nachgewiesen. Mit Hilfe des P60-Fc
Fusionsproteins und einem kommerziellen biotinylierten
Ziege-anti-Hund TNFα Antikörper konnte ein entsprechender
sensitiver ELISA aufgebaut werden. Gleichzeitig wurden ebenfalls im
WEHI-Bioassay die zwei humanen anti-TNFα Therapeutika Infliximab
und Ethanercept auf ihre Eigenschaft zur Bindung und Neutralisation
von caninem TNFα hin getestet Nur Ethanercept konnte dabei das
Zytokin binden und neutralisieren. Anschließend wurden Plasmaproben
von 79 klinisch an Sepsis erkrankten Hunden analysiert und im TNFα
ELISA quantifiziert. Keine der untersuchten Proben wies dabei
jedoch einen erhöhten Spiegel an TNFα im Plasma auf. Aus diesem
Grund wurden nun auch mit Hilfe zweier polyklonaler Seren gegen
rcanHMGB1 und gegen eine spezifische Peptidsequenz des Zytokins ein
Western Blot Verfahren und ein Capture ELISA für die Messung von
HMGB1 aufgebaut. HMGB1 konnte dabei allerdings sowohl bei gesunden
als auch bei sepsiskranken Hunden in vergleichbaren Mengen
nachgewiesen werden.