Entwicklung einer Real-Time PCR-Nachweismethode für Yersinia enterocolitica

Yersinia (Y.) enterocolitica ist ein bedeutender Lebensmittelkeim,
der vorwiegend in Schweinefleisch vorkommt. Kulturell ist er sehr
schwer nachzuweisen, da er auf Selektivagar sehr schnell von
anderen Keimen überwuchert wird. Zudem sind die kulturellen
Isolierungsmethoden sehr zeitaufwendig und eine Aussage über
pathogene oder apathogene Stämme kann aufgrund der Ergebnisse ohne
weitere Diagnostik nicht getroffen werden. Aus diesen Gründen wird
in der Diagnostik von Y. enterocolitica aus Lebensmitteln vermehrt
der PCR-Nachweis eingesetzt, welcher innerhalb von Stunden, bei
vorheriger Anreicherung nach einem Tag, ein zuverlässiges Ergebnis
liefert. Abhängig von der Wahl des Zielgenes werden nur pathogene
Keime detektiert. Die Sensitivität einer PCR ist in großem Maße von
der Aufreinigung abhängig, deshalb sollte ein PCR-Protokoll immer
einschließlich Probenvorbereitung etabliert werden. In der
vorliegenden Arbeit wurde ein Real-Time PCR-basiertes
Nachweisverfahren, zusammen mit der Probenvorbereitung, für Y.
enterocolitica in Lebensmitteln entwickelt. Nachgewiesen wurde das
chromosomale ail-Gen, sowie das auf dem Plasmid lokalisierte
virF-Gen. In Vorversuchen erfolgte die Optimierung von
verschiedenen Bedingungen für eine PCR, wie die
Mastermix-Konzentration, Primer-Konzentration und
Annealing-Temperatur. Anschließend erfolgte die Untersuchung von
gezielt kontaminierten Rinderhackfleischproben. Diese Proben wurden
nach Anreicherung mit sechs verschiedenen Extraktionsverfahren
aufgereinigt und anschließend mit drei PCR-Methoden, davon eine
Real-Time PCR mit SYBR Green und eine TaqMan Real-Time PCR sowie
eine konventionelle Multiplex-PCR mit Gelelektrophorese, auf Y.
enterocolitica untersucht. Parallel dazu wurde der klassische
kulturelle Nachweis mit Anreicherung in TSB und ITC und Ausstrich
auf CIN-Agar durchgeführt. Abschließend erfolgte die Untersuchung
von 150 Schweinefleischproben aus dem Handel. Diese wurden
ebenfalls mittels der drei PCR-Methoden und kulturell untersucht.
Die Aufreinigung der Proben erfolgte nach Anreicherung mit drei
Extraktionsmethoden, welche in den Versuchen mit den beimpften
Proben die besten Ergebnisse lieferten. Mit allen drei PCR-Methoden
konnten ail-positive Y. enterocolitica ab einer Impfmenge von 10
KbE/10 g Hackfleisch und nachfolgende Anreicherung nachgewiesen
werden. Der Nachweis des virF-Genes gelang nur mit der
konventionellen PCR, bei der SYBR Green Real-Time PCR konnte das
virF-Gen nur selten und nur bei sehr hohen Keimzahlen detektiert
werden. Bei der SYBR Green Real-Time PCR (ail) lagen die Ct-Werte
bei der niedrigsten Impfmenge von 10 KbE/10 g, je nach
Aufreinigungsmethode, im Bereich von 28,5 bis 34,8, bei der
höchsten Impfmenge von 105 KbE/10 g konnten Werte ab 19,6 Zyklen
erzielt werden. Die besten Ergebnisse konnten mit der Aufreinigung
der InstaGene Matrix (Biorad), dem Biorad Genomic Tissue Kit und
dem Qiagen DNeasy Tissue Kit erzielt werden. Mit diesen Methoden
erfolgt auch die Aufreinigung der Schweinefleischproben aus dam
Handel. Insgesamt konnte in 43 Proben (29 %) ail-positive Y.
enterocolitica detektiert werden. Die höchste Nachweisrate mit 42
positiven Proben (28 %) wurde mit der SYBR Green Real-Time PCR
erzielt, wogegen mit der TaqMan Real-Time PCR in 23 Proben (15 %)
und mit der konventionellen PCR nur in 20 Proben (13 %) pathogene
Y. enterocolitica detektiert werden konnten. Am höchsten war die
Nachweisrate nach Aufreinigung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit,
welcher schon in den Vorversuchen die beste DNA-Ausbeute lieferte.
Kulturell konnte in keiner Probe Y. enterocolitica nachgewiesen
werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Real-Time PCR eine
sensitive und schnelle Methode zum Nachweis von pathogenen Y.
enterocolitica in Lebensmitteln darstellt. Die Probenaufbereitung
mit dem Biorad Genomic Tissue Kit liefert eine hohe DNA-Ausbeute,
ist aber zeitaufwendig, wogegen die InstaGene Matrix zwar weniger
sensitiv, dafür aber wesentlich schneller ist. Die Real-Time PCR
mit SYBR Green eignet sich vor allem als kostengunstiges Screening,
positive Ergebnisse sollten noch mit der sequenzspezifischen TaqMan
Real-Time PCR bestätigt werden. Mit allen drei PCR-Methoden konnten
ail-positive Y. enterocolitica ab einer Impfmenge von 10 KbE/10 g
Hackfleisch und nachfolgende Anreicherung nachgewiesen werden. Der
Nachweis des virF-Genes gelang nur mit der konventionellen PCR, bei
der SYBR Green Real-Time PCR konnte das virF-Gen nur selten und nur
bei sehr hohen Keimzahlen detektiert werden. Bei der SYBR Green
Real-Time PCR (ail) lagen die Ct-Werte bei der niedrigsten
Impfmenge von 10 KbE/10 g, je nach Aufreinigungsmethode, im Bereich
von 28,5 bis 34,8, bei der höchsten Impfmenge von 105 KbE/10 g
konnten Werte ab 19,6 Zyklen erzielt werden. Die besten Ergebnisse
konnten mit der Aufreinigung der InstaGene Matrix (Biorad), dem
Biorad Genomic Tissue Kit und dem Qiagen DNeasy Tissue Kit erzielt
werden. Mit diesen Methoden erfolgt auch die Aufreinigung der
Schweinefleischproben aus dam Handel. Insgesamt konnte in 43 Proben
(29 %) ail-positive Y. enterocolitica detektiert werden. Die
höchste Nachweisrate mit 42 positiven Proben (28 %) wurde mit der
SYBR Green Real-Time PCR erzielt, wogegen mit der TaqMan Real-Time
PCR in 23 Proben (15 %) und mit der konventionellen PCR nur in 20
Proben (13 %) pathogene Y. enterocolitica detektiert werden
konnten. Am höchsten war die Nachweisrate nach Aufreinigung mit dem
Biorad Genomic Tissue Kit, welcher schon in den Vorversuchen die
beste DNA-Ausbeute lieferte. Kulturell konnte in keiner Probe Y.
enterocolitica nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die
Real-Time PCR eine sensitive und schnelle Methode zum Nachweis von
pathogenen Y. enterocolitica in Lebensmitteln darstellt. Die
Probenaufbereitung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit liefert eine
hohe DNA-Ausbeute, ist aber zeitaufwendig, wogegen die InstaGene
Matrix zwar weniger sensitiv, dafür aber wesentlich schneller ist.
Die Real-Time PCR mit SYBR Green eignet sich vor allem als
kostengunstiges Screening, positive Ergebnisse sollten noch mit der
sequenzspezifischen TaqMan Real-Time PCR bestätigt werden.