Verkürzung und Optimierung des Nachweises von Listeria monocytogenes in Milcherzeugnissen mittels Real-Time-PCR

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Real-Time PCR-Verfahren auf Basis
des TaqMan-Systems für die Detektion von Listeria spp. und von
Listeria monocytogenes entwickelt und hinsichtlich der
Anwendbarkeit für den Nachweis von Listerien in Milcherzeugnissen
und Umfeldproben überprüft. Der genusspezifische Nachweis für
Listeria spp. erfasst mit Listeria monocytogenes, Listeria innocua
und Listeria seeligeri die wichtigsten und am häufigsten in
Milchprodukten nachgewiesenen Listerienspezies. Wenn im gleichen
Nachweissystem anstelle der fluoreszenzmarkierten TaqMan-Sonde der
interkalierende Fluoreszenzfarbstoff SybrGreen verwendet wird, kann
das gesamte Genus Listeria, mit Ausnahme von Listeria grayi ssp.
grayi, nachgewiesen werden. Der speziesspezifische Nachweis für
Listeria monocytogenes erfasst alle getesteten Stämme dieser
Spezies (n = 34) und reagierte mit keiner anderen Spezies falsch
positiv. Bei der Untersuchung von Reinkulturen waren für beide
Nachweissysteme Keimzahlen von 104-105 KbE/ml für einen sicheren
Nachweis erforderlich. Nach der erfolgreichen Etablierung der
Nachweise für Reinkulturen wurden künstlich kontaminierte
Milchprodukte untersucht. Es wurden sowohl unproblematische
Matrizes wie pasteurisierte Vollmilch als auch Produkte mit einem
hohen Gehalt an Begleitflora wie Weichkäse untersucht. Hierbei
waren für einen zuverlässigen Nachweis niedriger Listerienzahlen
von 1-10 KbE/g, aufgrund inhibitorischer Einflüsse einiger
Probenmatrizes sowie der Begleitflora auf das Listerienwachstum,
Anreicherungszeiten in Halb-Fraser von bis zu 48 h erforderlich.
Eine negative Beeinflussung der PCR-Nachweise durch
Probenbestandteile wurde nicht beobachtet, wenn die Proben mit dem
PrepMan Ultra Reagenz aufbereitet wurden. Eine deutliche Verkürzung
der Nachweiszeit in problematischen Probenmatrizes konnte durch
Separation der Listerien aus der selektiven Anreicherungskultur
mittels paramagnetischer Partikel, die mit listerienbindenden
Proteinen aus Listeria-spezifischen Phagen beschichtet sind
(CBD-MS; KRETZER, 2006), erreicht werden. Die separierten Listerien
wurden nach einem kurzen nicht selektiven Anreicherungsschritt (3 h
in Trypton-Soja- Bouillon mit Hefeextrakt) mit dem PrepMan Ultra
Reagenz aufbereitet und in der PCR eingesetzt. Mit dieser Methode
konnte die selektive Anreicherung auf 20 h und die
Gesamtnachweiszeit auf 29 h reduziert werden.