Die molekulare Charakterisierung des Gendefektes bei PVDR I-Schweinen

In dieser Studie wurde der genetische Defekt der 25-Hydroxyvitamin
D3 1α-Hydroxylase (CYP27B1) der PVDR I-Schweine beschrieben. Diese
Tiere stellen ein gutes Modell für die
Pseudo-Vitamin-D-Mangel-Rachitis Typ I (PVDR I) dar. Die
1α-Hydroxylase ist ein Enzym, dass 25(OH)D3 zu seiner hormonellen
Form aktiviert. Wie bei der echten Vitamin-D-Defizienz resultiert
die Unfähigkeit Vitamin D3 zu aktivieren in Symptomen der Rachitis.
Diese Tiere zeigen niedriege 1,25(OH)2D3-Blutspiegel, hochgradige
Hypocalcämie, rachitische Veränderung des Skeletts und erhöhte
Parathormon-Blutwerte. Diese Störung trat als spontane Mutation in
den 60iger Jahren bei einer Zuchtlinie in Hannover auf. Wir konnten
eine Splice-Site-Mutation in der Splice-Donor-Site von Intron 6
(IVS6+1G>A) ausfindig machen. In der cDNA von renalen und
nicht-renalen Geweben wurde eine Deletion von Exon 6 gefunden, die
in einem Frameshift und in einem verfrühten Stop-Codon resultiert.
Zudem analysierten wir die Promotor-Region und die genomische
Organisation des porcinen 1α-Hydroxylase-Gens bei dem eine hohe
Homologie zum humanen 1α-Hydoxylase-Gen festgestellt wurde. Darüber
hinaus wurde die Expression in der Niere und verschiedenen
nicht-renalen Geweben, wie der uterinen Cervix, Haut, Lymphknoten,
Nebenniere und dem Colon, ermittelt. Da alle Gewebe dieselbe
defekte 1α-Hydroxylase exprimieren, gehen wir davon aus, dass das
Enzym in den PVDR I-Schweinen enzymatisch inaktiv ist. Die
Information über die Punktmutation wurde für die Entwicklung einer
neuen, PCR-basierten Genotypisierungsmethode genutzt. Durch die
Mutation wurde eine einmalig vorkommende Restriktionsschnittstelle
für Bpu10I ausgelöscht, was die Genotypisierung mittels
Restriktions-Längen-Fragment-Polymorphismus (RFLP) erlaubte.
Zusätzlich etablierten wir eine
Amplifikations-Refraktär-Mutations-System-PCR (ARMS), um die
Genotypisierung von homozygoten, heterozygoten und
Wildtyp-Genotypen zu vereinfachen. Die Expressionsspiegel der
1α-Hydroxylase wurden in einigen Geweben mittels quantitativer PCR
in Wildtyp- und homozygoten Tieren bestimmt. In der Niere war die
Expression gegenüber den Wildtyp-Tieren signifikant reduziert,
wobei in der Haut keine Unterschiede gefunden wurden. Die
Aktivierung von Blut-Makrophagen, mit Hilfe von Interferon γ,
bewirkte einen Anstieg der 1α-Hydroxylase-Expression. Die
regulatorischen Unterschiede in renalen und nichtrenalen Geweben
wurden diskutiert. Diese Ergebnisse erlauben es das PVDR I-Schwein
als Tiermodell für die Pseudo-Vitamin-D-Mangel-Rachitis Typ I
nutzen zu können, um Studien der Regulation des
Vitamin-D-Metabolismus und des Calciumstoffwechsels beim Schwein
durchführen zu können.