Charakterisierung von Antikörpern und ihrer immunsuppressiven Wirkung im präklinischen Transplantationsmodell des Hundes

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung von
Antikörpern und ihrer immunsuppressiven Wirkung im präklinischen
Hundemodell. Dazu wurde eine T-Zelldepletionsmethode mit dem
caninen CD6-Antikörper MT-606 und Kaninchen-komplement zur
alleinigen GvHD-Prophylaxe bei der allogenen
Knochenmark-transplantation entwickelt. Zusätzlich sollten die
regulatorischen Eigenschaften von CD6-depletierten
Knochenmarkzellen in vitro in der gemischten Lymphozytenkultur
untersucht werden. Mit Hilfe des kreuzreagierenden Antikörpers
MT-606, der das canine CD6-Antigen erkennt, konnte eine einfache
und kostengünstige Depletionsmethode etabliert werden, welche die
Fähigkeit des CD6-Antikörpers MT-606 zur Aktivierung der
Komplement-kaskade ausnützt. Es wurde zunächst durch in
vitro-Experimente gezeigt, dass die Methode mit MT-606 und
Kaninchenkomplement eine effektive Depletion der CD6-positiven
Zellen gewährleistet, wohin gegen die hämatopoetischen Stammzellen
unangetastet bleiben. Die CD6-Depletion geht einher mit einer
nahezu vollständigen Depletion der CD4-positiven Zellen, während
die CD8-positiven Zellen nur teilweise depletiert werden. Durch
drei Knochenmarktransplantationen im homo-hetero-System und zwei im
DLA-identischen System wurde gezeigt, dass sich die CD6-Depletion
als alleinige Methode zur GvHD-Prophylaxe eignet. Die Etablierung
einer Toleranz gegenüber dem Spenderorganismus wurde durch eine
Hauttransplantation vom Spender auf den Empfänger bei einem Hund
gezeigt. Regelmäßige Analysen des Spenderchimärismus konnten
zeigen, dass die Transplantation von CD6-depletiertem Knochenmark
eine langfristige Erholung des hämatopoetischen Systems garantiert.
In mehreren in vitro-Experimenten sollte die regulatorische
Fähigkeit von CD6-depletierten Knochenmarkzellen in der gemischten
Lymphozytenkultur (MLC) untersucht werden. Die MLC ist eine
Kurzzeit-Suspensionskultur, die es erlaubt, die Reaktivität von
T-Zellen eines Spenders gegen die durch Bestrahlung inaktivierten
PBMCs eines anderen Spenders zu untersuchen. Die
Lymphozytenproliferation oder ihre eventuelle Inhibition können
durch den Einbau von radioaktiv markiertem Thymidin oder durch die
Weitergabe des Farbstoffs CFSE von der Mutter- auf die
Tochterzellen quantifiziert werden. Trotz Anwendung
unterschiedlicher Analysesysteme konnte kein supprimierender Effekt
von CD6-depletierten Knochenmarkzellen auf die
Lymphozytenproliferation in der gemischten Lymphozytenkultur
nachgewiesen werden. In einigen Fällen wirkten die CD6-depletierten
Knochenmarkzellen sogar stimulierend auf die Proliferation der
Lymphozyten. Um die generelle Anwendbarkeit des verwendeten
MLC-Systems zum Nachweis von supprimierenden Eigenschaften einer
Zellpopulation zu zeigen, wurden mesenchymale Stammzellen an Stelle
von CD6-depletierten Knochenmarkzellen eingesetzt. Diese bewiesen
eine hohe Potenz zur Unterdrückung der Lymphozytenproliferation in
der MLC. Trotz offensichtlicher Wirkung bei der GvHD-Prophylaxe
konnte ein regulatorischer Effekt von CD6-depletierten
Knochenmarkzellen in der MLC nicht gezeigt werden, obwohl das
System durchaus zum Nachweis von supprimierenden Eigenschaften
anderer Zellen geeignet ist. In einer zweiten Reihe von
Transplantationen wurde untersucht, ob durch zusätzliche
Transfusion von Spenderlymphozyten (DLT) nach der Transplantation
von CD6-depletiertem Knochenmark im Empfänger eine GvHD induziert
werden kann. Der Zeitpunkt der DLT variierte bei den einzelnen
Transplantationen, es wurde aber immer eine Zelldosis von ca. 1 ∙
108 MNCs/kg Körpergewicht transfundiert. Bei je einem Hund konnte
durch DLT an den Tagen 3, 14 oder 20 eine GvHD induziert werden,
deren Hauptmanifestationsort bei zwei Hunden die Leber und bei
einem Hund die Haut war. Bei einer Wiederholung des
Transplantationsschemas mit DLT an Tag 20 konnte bei einem weiteren
Hund keine GvHD induziert werden. Offensichtlich bestand zu diesem
Zeitpunkt bereits eine Toleranz gegenüber dem Spenderorganismus.
Das etablierte System mit Transplantation von CD6-depletiertem
Knochenmark und DLT vor Tag 20 zur Induktion einer GvHD eignet sich
hervorragend, um die Einsetzbarkeit von HSV-TK-transduzierten
Zellen zur Gentherapie zu testen. Dies wird Gegenstand zukünftiger
Untersuchungen sein.