Funktionelle Charakterisierung von Doppeldeletionsmutanten des Bovinen Herpesvirus Typ 1 als Basis einer neuen Markervakzineformulierung

Ziel dieser Arbeit war es BoHV-1 Doppeldeletionsmutanten zu
generieren, zu charakterisieren und bezüglich ihrer Vakzineeignung
zu bewerten. Die vorgestellten Studien zur Charakterisierung eines
gE und UL49.5 deletierten Virus (BoHV-1-DgEDUL49.5) konnten
belegen, dass diese Deletionskombination als letal für BoHV-1
anzusehen ist. Ein UL49.5 deletiertes Virus verhielt sich dagegen
funktionell wie ein Virus ohne UL49.5/gM-Komplex. Ähnlich wie bei
anderen Alpha-Herpesviren war hier wahrscheinlich der zweite
Umhüllungsschritt im Zytoplasma der infizierten Zelle gestört, so
dass keine infektiöse Virusnachkommenschaft gebildet wurde. Ein
Virus mit Deletionen der Genorte UL49 und gE (BoHV-1-DgEDUL49)
zeigte hingegen fast keine Beeinträchtigungen im Hinblick auf die
Replikationsfähigkeit. Dagegen war die Ausbreitungsmöglichkeit von
Zelle-zu-Zelle (cell-to-cell-spread CTCS) einer solchen Mutante im
Vergleich zu den entsprechenden einzel-deletierten Viren erheblich
verringert. Da es sich hierbei um eine synergistische Verstärkung
gegenüber den Einzelmutanten handelte, wurde geschlussfolgert, dass
beide Proteine an derselben Funktionskette des CTCS beteiligt sind.
Da die doppelt UL49 und gE deletierte Mutante allerdings weiterhin
extrazelluläre, infektiöse Virusnachkommenschaften bildete, ist der
CTCS als unabhängige Ausbreitungsform offensichtlich durch andere
Funktionen bedingt als der klassische Weg der Virusausschleusung.
Hinweise darauf, dass gE auch bei BoHV-1 mit pUL49 interagiert
konnten dabei durch Kolokalisationsstudien im Laserscanmikroskop
abgeleitet werden. Allerdings ließ keine dieser BoHV-1-Mutanten
eine besondere Eignung als Vakzinestamm erkennen. Ein gE und TK
doppelt deletiertes Virus zeigte hingegen in vitro kaum veränderte
Wachstumseigenschaften verglichen mit dem einfach gEdeletierten
Virus. Diese Deletionskombination sollte zudem gegenüber einer
Virulenzsteigerung durch Rekombination mit Feldviren
unempfindlicher sein, als die derzeit erhältlichen Lebendvakzinen.
Zur Steigerung der immunogenen Wirkung des Lebendvirus wurde dieser
neue Stamm (BoHV-1DgEDTK) in Kombination mit einem adjuvierenden,
nicht viruziden, Blockpolymer eingesetzt. Dieser Ansatz wurde in
einem Tierversuch an Kälbern im Vergleich zu der Immunisierung mit
dem nicht adjuventierten Lebendvirus getestet. Im Ergebnis dieses
Tierversuches schieden die Tiere, welche adjuventiert immunisiert
wurden, weniger Virus und zudem für eine kürzere Zeit aus. Dies
galt im Vergleich mit den nicht immunisierten Kontrolltieren wie
auch im Vergleich mit den Tieren, die allein das Lebendvirus zur
Immunisierung appliziert bekommen hatten. Auch die Quantifizierung
der neutralisierenden Antikörper verdeutlichte eine gesteigerte
Immunogenität der Kombination des doppelt deletierten Lebendvirus
mit dem Adjuvants. Die sehr gute Immunitätslage der Tiere nach
Impfung führte allerdings nach Belastungsinfektion auch zu einer
zeitlich verzögerten Serokonversion im Markertest auf Basis des
Nachweises von gE-spezifischen Antikörpern. Auch dies muss als
Beleg für die hervorragende, immunisierende Leistung der neuen
Präparation angesehen werden, da offensichtlich bei einigen der
immunisierten Tiere die Virusreplikation soweit unterdrückt wird,
dass keine gEspezifische Antikörperantwort mehr erfolgt. Die
vorgestellte Kombination eines genetisch überattenuierten
Lebendvirus und die Verstärkung der immunogenen Eigenschaften durch
Zusatz eines nicht viruziden, potenten Adjuvants können die
Grundlage für eine zukünftige Vakzinestratgie zur Bekämpfung der
BoHV-1 oder anderer herpesviraler Infektionskrankheiten bilden.