Kraftspektroskopische Untersuchung einzelner Zytoskelett-Proteine

Die Kraftspektroskopie hat sich als eine moderne Methode zur
Untersuchung der Elastizität und Entfaltung einzelner Proteine
etabliert. Kraftspektroskopische Experimente zeichnen sich unter
anderem dadurch aus, dass die Entfaltungskinetik einzelner Proteine
bestimmt werden kann. In dieser Arbeit wurde die Kraftspektroskopie
zur Analyse der Elastizität und der Entfaltungskinetik einzelner
Zytoskelett-Proteine verwendet. Die untersuchten Moleküle, die
Superhelix-Struktur des Myosin Schwanzes und das Aktin-bindende
Protein Filamin (ddFLN) repräsentieren dabei zwei wichtige
Strukturmotive der Proteinfaltung. Die Messungen wurden mit dem
Ziel durchgeführt, ein detailliertes Verständnis hinsichtlich des
Zusammenhangs zwischen der Struktur der Proteine und deren
mechanischen Eigenschaften zu gewinnen. Der Anwendungsbereich der
Methode konnte mit Hilfe eines neu entwickelten Messprotokolls
erweitert werden. So wurde in Rückfaltungsexperimenten neben der
Entfaltungskinetik auch die Rückfaltungskinetik einzelner Proteine
bestimmt. Die kraftspektroskopische Untersuchung des Schwanzes des
Muskelmotor-Proteins Myosin II zeigte, dass das Molekül über
elastische Dehnungseigenschaften verfügt. Die Superhelix-Struktur
des Schwanzes weist ein charakteristisches Kraftdehnungsverhalten
auf, das bei Dehnung und Entspannung des Moleküls reversibel ist.
Das Kraftdehnungsverhalten der Superhelix konnte erfolgreich durch
ein Zwei-Zustands-Modell analytisch beschrieben werden. Das Modell
beruht auf der Annahme, dass einzelne Segmente der Helix entweder
einen gefalteten oder entfalteten Zustand einnehmen. Ferner liegt
dem Modell zugrunde, dass ein thermodynamisches Gleichgewicht beim
Übergang zwischen den Zuständen besteht. In den Experimenten mit
dem Aktin-bindenden Protein ddFLN wurden die Entfaltungskräfte der
Immunoglobulindomänen sowie die mechanische Stabilität der
Dimerbindung des inelastischen Moleküls bestimmt. Es zeigte sich,
dass die Dimerbindung im Vergleich zu den benachbarten Domänen von
ddFLN über eine größere mechanische Stabilität verfügt. Experimente
mit verschiedenen Konstrukten des Moleküls zeigten außerdem, dass
die Entfaltung einer der ddFLN-Domänen, nämlich Domäne 4 (ddFLN4),
über einen stabilen Zwischenzustand erfolgt. Auf Basis der
NMR-Struktur und der kraftspektroskopischen Daten verschiedener
Mutationen von ddFLN4 wurde eine Analyse der Primärstruktur dieses
Zwischenzustandes vorgenommen. Demnach entfalten im ersten
Entfaltungsschritt 50 Aminosäuren, währenddessen die restlichen 50
Aminosäuren von ddFLN4 den stabilen Zwischenzustand bilden.
Wiederholtes Dehnen und Entspannen von ddFLN ergab, dass es sich
bei dem Entfaltungszwischenzustand von ddFLN4 ebenfalls um einen
Faltungszwischenzustand handelt. Die Analyse der
Rückfaltungsereignisse führte zu dem Ergebnis, dass die Rückfaltung
von ddFLN4 nur durch ein kinetisches Drei-Zustands-Modell mit einem
obligaten Zwischenzustand beschrieben werden kann. Der
Zwischenzustand stellt also einen „on-pathway“ Zwischenzustand dar,
der von ddFLN4 zuerst eingenommen wird, bevor die Domäne in ihre
native Struktur übergeht. Die quantitative Bestimmung der
Faltungskinetik von ddFLN4 erfolgte durch Anpassung des Modells an
die Daten. Der Vergleich der Faltungskinetik von ddFLN4 und allen
anderen Domänen von ddFLN führte zu dem Ergebnis, dass ddFLN4 mit
Zwischenzustand eine ca. 10fach schnellere Faltung aufweist, obwohl
alle Domänen eine homologe Struktur besitzen. Domäne ddFLN4 stellt
demnach ein Beispiel dar, inwiefern ein Faltungszwischenzustand zu
einer substantiellen Beschleunigung der Faltung führen kann.