Einzelmolekül-Kraftspektroskopie an molekularen Maschinen und Rezeptor-Ligand-Systemen

Biologische molekulare Maschinen erfüllen in der Natur zentrale
Aufgaben und erstrecken sich über alle Bereiche des Lebens. Ihren
Aufbau und ihre Funktionsweise im Detail zu untersuchen und zu
verstehen, ist ein großes Feld der aktuellen Forschung. Inspiriert
durch die biologischen molekularen Maschinen wurde in den letzten
Jahren versucht, künstliche molekulare Maschinen aufzubauen. Einer
dieser Ansätze verwendet ein photoaktives Polymer, das durch das
Bestrahlen mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge kontrahiert oder
relaxiert werden kann. Wird dieses photoaktive Polymer an ein
Kraftspektroskop gekoppelt und über Totale Interne Reflexion (TIR)
angeregt, so lässt sich damit eine künstliche molekulare Maschine
realisieren, die aus einem einzelnen Polymer besteht. Bestandteil
dieses photoaktiven Polymers sind Azobenzoleinheiten, die
reversibel zwischen der cis- und der trans-Konformation geschaltet
werden können. Dadurch wird das Polymer (Azobenzolpolypeptid)
kontrahiert oder relaxiert und kann Arbeit an der Cantileverspitze
des Kraftspektroskops verrichten. Ein Ziel dieser Arbeit war es,
ein detailliertes Verständnis dieser künstlichen molekularen
Maschine zu erlangen. Dazu wurde zuerst das Schalten der
Azobenzoleinheiten im Polymer bei niedriger Kraft demonstriert.
Anschließend wurde eine externe Kraft angelegt und beobachtet, dass
sich das Schaltverhalten erst bei sehr hohen Kräften verändert. Das
zweite Ziel war die Entwicklung eines theoretischen Modells, zur
Beschreibung der Kraft-Abstandskurve des Azobenzolpolypeptid über
den gesamten Kraftbereich. Dazu wurden ab-initio quantenmechanische
Rechnungen für das Azobenzol durchgeführt und mit dem Modell der
„Frei-Rotierenden-Kette“ kombiniert. Dieses Modell hat den Vorteil,
dass es mit der Segmentlänge und der Anzahl der Monomere als
Fittparameter auskommt. Es ist nun möglich die Kraft-Abstandskurven
des Azobenzolpolypeptid direkt durch die Anzahl der
Azobenzoleinheiten in der trans- und in der cis-Konformation über
den ganzen Kraftbereich (0 bis 1000pN) zu beschreiben. Das
Schaltverhalten des Polymers wird damit durch das Verhältnis der
Anteile im cis- bzw. trans-Zustand ausgedrückt. Ein weiterer
Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung eines
Rezeptor-Ligand-Systems. Am Beispiel des anti-Digoxigenin
Antikörpers gegen Digoxigenin wurden Experimente über einen großen
Bereich von Kraftladungsraten durchgeführt. Dadurch zeigte sich,
dass die bisherige Analysemethode nur grobe Einblicke in die
Energielandschaft der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zulässt. Es
konnte beispielsweise eine natürliche Dissoziationsrate von
koff=0.015s-1 aus den kraftspektroskopischen Experimenten bestimmt
werden, die mit Messungen an Fv-Fragmenten am Ensemble gut
übereinstimmen (koff=0.023s-1). Aussagen bezüglich der
Energielandschaft gestalteten sich schwieriger. Zuerst wurde das
Maximum der Krafthistogramme als Funktion der Maxima der
Ladungsratenhistogramme in einem Diagramm dargestellt. Dieses
Diagramm wurde nach der Methode von Evans ausgewertet. Daraus ergab
sich für den niedrigen Ladungsratenbereich die obige
Dissoziationsrate von koff=0.015s-1 und eine Potentialweite von
Dx=1.15nm. Für den hohen Ladungsratenbereich ergab sich eine
Dissoziationsrate von koff=4.56s-1 und eine Potentialweite von
Dx=0.35nm. Mit diesen Werten wurde nun versucht, die einzelnen
Krafthistogramme für alle Ladungsraten zu fitten. Es hatte sich
gezeigt, dass es bei niedrigen und bei hohen Ladungsraten eine
Übereinstimmung zwischen dem gemessenen Krafthistogramm und der
berechneten Wahrscheinlichkeitsverteilung gab. Allerdings konnte
bei sehr hohen Ladungsraten und in dem Übergansbereich zwischen den
beiden Bereichen keine Übereinstimmung erzielt werden. Daher sind
Aussagen über die Energielandschaft nur beschränkt möglich. Um eine
vollständige Auswertung der experimentellen Daten zu erreichen,
werden weitere Entwicklungen bezüglich des theoretischen Modells
nötig sein. Ein Ansatz besteht darin, ein mögliches Potential
anzunehmen und darauf die Theorie von Kramers anwenden. Das
Ergebnis wäre dann eine kraftabhängige Dissoziationskonstante koff
für ein spezielles Potential. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit
ein Mehrkanal-Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (SPR)-Spektrometer
aufgebaut und charakterisiert.