Analyse der Funktion der NS-Proteine von klinischen HRSV-Isolaten

HRSV ist eine häufige und weltweit verbreitete Ursache von
Infektionen des Respirationstraktes. Es führt zu einer
entzündlichen Erkrankung der respiratorischen Schleimhäute mit
Mukosaödem, Hypersekretion und Bronchospasmus. Die Übertragung des
viralen Erregers erfolgt durch Tröpfcheninfektion oder Kontakt mit
kontaminierten Gegenständen. HRSV-Infektionen zeigen die höchste
Inzidenz bei Säuglingen, vor allem in den ersten zwei bis sechs
Lebensmonaten. Bei 25% bis 40% dieser Säuglinge nimmt die
Erkrankung einen schweren Verlauf mit Befall des unteren
Respirationstraktes in Form einer HRSV-Bronchiolitis oder
-Pneumonie. Bei 0,5% bis 2,0% ist eine stationäre Behandlung im
Krankenhaus erforderlich. Die Inzidenz nimmt wegen des zunehmend
effektiveren Immunsystems mit dem Alter ab. Erwachsene und ältere
Kinder zeigen meist keine Symptome bzw. Symptome einer leichten
Erkältung. Reinfektionen im Laufe des Lebens sind häufig. Eine
effektive kausale Therapie bei HRSV-Infektionen steht derzeit nicht
zur Verfügung. Bei Patienten mit leichtem Krankheitsverlauf ist
keine spezielle Behandlung erforderlich, therapiert wird
symptomatisch. Aktuell ist keine spezifische Prävention in Form
einer aktiven Impfung oder als effektive antivirale Therapie
etabliert. Angesichts der hohen Inzidenz von HRSV-Infektionen und
-Reinfektionen sowie der enormen gesundheitlichen und
wirtschaftlichen Auswirkungen ist ein effektiver Impfstoff gegen
HRSV als Forschungsziel vorrangig. Das Genom von HRSV, das zur
Ordnung der Mononegavirales gehört, besteht aus einem
negativ-orientierten RNA-Einzelstrang mit einer Länge von 15 222
Nukleotiden (beim A2-Stamm) und kodiert für zehn subgenomische
mRNAs in der Reihenfolge 3’-leader, NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F,
M2(1+2), L, trailer-5’, die zur Expression von elf viralen
Proteinen führen: fünf RNP-assoziierte Proteine, das sind das
Nukleoprotein N, das Phosphoprotein P, die große katalytische
Untereinheit L der RNA-Polymerase und der
Transkriptionselongationsfaktor M2-1 sowie das nicht essentielle
M2-2-Protein; vier Hüllproteine, dazu zählen das
nicht-glykosylierte Matrixprotein M und drei Oberflächenproteine,
im Einzelnen das Fusionsprotein F, das Anheftungsprotein G und das
kleine hydrophobe Protein SH; zwei Nicht-Strukturproteine NS1 und
NS2. NS1 und NS2 zeichnen die Pneumoviren vor allen anderen Viren
der Ordnung der Mononegavirales aus. Beide NS-Proteine sind im
Virion nur in Spuren nachweisbar, während sie in infizierten Zellen
akkumulieren. Die beiden für die Proteine NS1 und NS2 kodierenden,
nichtüberlappenden Gene liegen am 3‘-Ende des Genoms direkt im
Anschluss an die leader-Region. NS1 und NS2 stimmen in den vier
carboxyterminalen Aminosäuren überein, ansonsten weisen sie keine
Sequenzähnlichkeiten auf. Das NS1-Gen hat eine Länge von 552 nt und
kodiert für ein leicht saures Protein von 139 AS und 15,7 kD. Das
NS2-Gen ist 503 nt lang und kodiert für ein basisches Protein von
124 AS und 14,7 kD. Die für die Ordnung der Mononegavirales
charakteristische progressive Attenuation der Transkription sowie
die Genlokalisation von NS1 und NS2 am 3‘-Ende lassen auf die
höchste Transkriptionsrate für NS1- und NS2-mRNA unter den zehn
HSRV-mRNA schließen, was auf eine bedeutende Rolle der NS1- und
NS2-Proteine in infizierten Zellen hindeutet. NS1 und NS2
antagonisieren im Zusammenwirken die durch alpha-IFN und beta-IFN
induzierte antivirale Antwort des Wirtsorganismus. Hierfür ist eine
Koexpression beider NS-Proteine unbedingt erforderlich, ein
NS-Protein allein zeigt keine derartige Aktivität. Der Mechanismus,
mit dem HRSV die IFN-Antwort des Wirtsorganismus umgeht, ist
unklar. In dieser Arbeit wurde die Funktion der NS-Proteine von
klinischen HRSV-Isolaten aus fünf bis fünfzehn Monate alten Kindern
untersucht. Durch die Anzucht der klinischen HRSV-Isolate in
HEp-2-Zellkultur unter identischen Bedingungen wurden zunächst
patientenabhängige Faktoren ausgeschaltet und damit die Grundlage
für die Vergleichbarkeit der Wachstumseigenschaften der Isolate
geschaffen. In den daraufhin erstellten Wachstumskurven konnten
deutlich voneinander abweichende Wachstumverhalten der Isolate
aufgezeigt werden. Der Befund, dass 3/4 der Bronchiolitis
hervorrufenden HRS-Viren hohe infektiöse Titer (>106 infektiöse
Viruspartikel/ ml an Tag 3) erreichten, während dies nur bei 1/3
der Bronchitis verursachenden Viren zu beobachten war, könnte auf
eine Korrelation zwischen Wachstum in vitro und Pathogenität in
vivo hindeuten. Um dies zu belegen, müsste eine größere Zahl von
klinischen Isolaten analysiert werden. Die beiden
Nicht-Strukturproteine versetzen HRSV in die Lage, die antivirale
IFN-Antwort der Wirtszelle zu umgehen. Durch Behandlung von
Virus-infizierten Zellkulturen mit IFN ließ sich nachweisen, dass
alle klinischen HRSV-Isolate die Eigenschaft der IFN-Resistenz
gleichermaßen besitzen und erst durch unphysiologisch hohe IFN
Dosen eine wesentliche Inhibierung der Virusreplikation erreicht
werden kann. Die in gleicher Weise ausgeprägte α-IFN-Resistenz bei
den in Virulenz und Wachstumsgeschwindigkeit unterschiedlichen
Viren deutete bereits darauf hin, dass diese Resistenz essentiell
für alle klinischen RSV-Isolate ist, und dass zusätzliche Faktoren
für das Maß der Aggressivität der Erreger verantwortlich sind.
Mittels Nukleotid- und Aminosäuresequenzanalysen von NS1 und NS2
konnte dies weitgehend bestätigt werden. Anhand von RNA aus den
HRSV-Isolaten wurde mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase cDNA
von NS1 und NS2 synthetisiert, die nach dem Prinzip der PCR in
vitro amplifiziert wurde. In anschließenden Klonierungsarbeiten
wurden aus dem Vektor pBluescript II SK (–) und NS1-DNA bzw.
NS1+NS2-DNA als Insert Plasmide konstruiert, in denen die
Gensequenzen von NS1 und NS2 ermittelt und rechnergestützt in die
entsprechenden Aminosäuresequenzen translatiert wurden. Die Analyse
der NS-Sequenzen zeigte eine überraschend hohe Konservierung. Die
Isolate waren einschließlich des Long-Stamms diesbezüglich
untereinander sehr ähnlich. Diese Beobachtung stimmt mit der
IFN-Resistenz überein und zeigt die Bedeutung der NS-Proteine. Die
Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Abweichungen in
den Sequenzen der übrigen Gene sowie patientenbezogene Faktoren wie
Abwehrlage und anatomische Beschaffenheit des Respirationstraktes
als Grund für die Unterschiede im Schweregrad der HRSV-Infektion
eine Rolle spielen. Angesichts der stabilen Koexpression beider
Nicht-Strukturproteine und des dadurch bedingten effektiven
IFN-Escape sichern die Gene NS1 und NS2 die Überlebensfähigkeit von
HRSV in vivo und stellen ebenso geeignete wie interessante
Angriffspunkte in der Entwicklung eines attenuierten
Lebendimpfstoffs dar.