Monoklonale Antikörper für die Analyse der Genexpression in neuronalen Geweben

Monoklonale Antikörper sind unverzichtbare Hilfsmittel, um
Proteinkomplexe aus Zellen zu isolieren oder Proteine in
Gewebeschnitten zu lokalisieren. Sie dienen auch dazu,
Entwicklungsvorgänge aufzuklären. Dabei wird als Modellorganismus
für Vertebraten oft der Zebrafisch gewählt, da er sich asaisonal
vermehrt, eine zahlreiche Nachkommenschaft hat und sowohl die
Befruchtung als auch die Entwicklung außerhalb des Mutterleibs
erfolgt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden monoklonale Antikörper
generiert, die spezifisch mit neuronalen Geweben und Organen des
Zebrafisches reagieren. Zur Immunisierung wurde Gehirngewebe des
Zebrafisches verwendet. Immunisiert wurden Ratten.
Antikörperbildende B-Zellen aus der Ratte wurden mit einer
Mausmyelom-Zelllinie fusioniert. Proteine von Interesse wurden mit
Hilfe der Antikörper aus Zelllysaten des Zebrafisch-Gehirns
immunpräzipitiert und durch Elektrophorese in Polyacrylamidgelen
aufgetrennt. Die durch Antikörper detektierbaren Banden wurden
ausgeschnitten und die enthaltenen Proteine mit
massenspektrometrischen Techniken identifiziert. In einem weiteren
Ansatz diente eine in λ-Phagen einklonierte Genbank der Expression
der Proteine. Die Proteine wurden ebenfalls mit monoklonalen
Antikörpern identifiziert. Die Phagen, die diese Proteine
produzierten, wurden vermehrt und die für das Protein kodierende
DNA sequenziert. Wir haben unsere Anstrengungen vor allem auf
Proteine neuronalen Ursprungs konzentriert, weil diese Strukturen
in den Fischen besonders deutlich markiert wurden. Histologische
Untersuchungen an anderen Spezies ergaben, dass die Antikörper mit
neuronalen Strukturen vieler Spezies reagierten, was auf eine hohe
Konservierung der Proteine in der Phylogenese schließen lässt. Aus
drei Fusionen mit Milzzellen von immunisierten Ratten wurden 2400
Zellüberstände erzeugt, die auf ihre Immunglobulin-Subklasse
getestet wurden. IgG-positive Überstände wurden auf histologischen
Schnitten untersucht. Schließlich wurden 17 Klone etabliert, die
mit Nervengewebe des Zebrafisches reagierten, und weitere 9 Klone,
die sowohl mit neuronalen Zellen des Zebrafisches als auch mit
neuronalem Gewebe anderer Spezies reagierten. Die von den einzelnen
Antikörpern erkannten Proteine wurden entweder
massenspektrometrisch oder mittels einer Expressionsgenbank, die
aus drei Tage alten Zebrafischlarven hergestellt wurde,
identifiziert. Es wurden Antikörper gegen folgende Proteine
gefunden: 1. Tenascin R 2. Plasticin 3. TOPAP 4. VAT-1 Es wurden 16
monoklonale Antikörper, die gegen fünf verschiedene humane Antigene
hergestellt worden waren, auf Kreuzreaktivität mit Zebrafischgehirn
getestet. Die Antikörper reagierten sowohl mit dem Hirn des
Zebrafisches als auch mit dem Hirn acht verschiedener
Säugerspezies. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Versuch
unternommen, gezielt gegen ein Fusionskonstrukt, das Teile des
humanen Parkins enthielt, monoklonale Antikörper herzustellen. Aus
vier Fusionen wurden nur drei spezifisch mit dem Antigen
reagierende Antikörper selektiert, die auch im Western-Blot mit
Parkin reagierten. In vivo wurde das Antigen in histologischen
Schnitten jedoch nicht erkannt.