Untersuchungen zur tumorspezifischen Geninaktivierung über Methylierung in gastrointestinalen Karzinomen

Die Grundlage für die Entstehung von Tumoren bildet der Erwerb
genetischer Veränderungen, wobei neben Mutationen wie
Chromosomeninstabilitäten, Insertionen, Deletionen oder
Basenmutationen auch epigenetische Vorgänge von Bedeutung sind.
Hierzu zählt die veränderte Methylierung von DNA in neoplastisch
transformierten Zellen, die bei einigen Genen in deren
transkriptionellen Inaktivierung resultiert. Im Rahmen der
vorliegenden Arbeit sollten Kolon- und Magenkarzinome auf
bestehende Methylierungsdefekte in zwei Genen untersucht werden. Im
ersten Teil wurde ein in die Mismatch-Reparatur involviertes Gen,
das hMLH1-Gen, untersucht. Gastrointestinale Karzinome wurden
hierbei hinsichtlich eines Zusammenhangs zwischen ihrer
Mikrosatelliten- instabilität und einer möglichen Methylierung von
Cytosinbasen im hMLH1-Promotor analysiert. Hierfür kam die
Bisulfitmethode zur Anwendung, bei der die Umwandlung von
unmethylierten Cytosinbasen zu Uracil erfolgt und die damit die
Grundlage für die anschließende methylierungssensitive PCR bildet.
Insgesamt ließ sich die Mikrosatelliten- instabilität bei sieben
von neun untersuchten Karzinomproben auf Methylierung der
proximalen Promotorsequenz zurückführen. Der Methylierungsstatus
der beiden übrigen mikrosatelliteninstabilen Tumoren konnte nicht
eindeutig bestimmt werden, obwohl die Vollständigkeit der
Bisulfitmodifikation über den Nachweis des maternalen
Methylierungsmusters des Exons 1 von SNRPN bestätigt wurde.
Überdies konnte eine Deletion dieser Sequenz mittels Überprüfung
der unbehandelten DNA ausgeschlossen werden. Gegenstand des zweiten
Teils dieser Arbeit war die Untersuchung des CD95-Gens, eines
Mitglieds der Tumor- Nekrose-Faktor-Rezeptor-Familie (sog.
Todesrezeptoren), das eine entscheidende Rolle bei der ungestörten
Apoptose von Zellen spielt. Grundlage hierfür waren die Ergebnisse
von Peli et al., 1999, denen zufolge die CD95-Expression in
mehreren etablierten Säugetierzellinien durch onkogenes Ras (H-Ras)
herunterreguliert wird, wodurch sich eine Resistenz der Zellen für
CD95L-induzierte Apoptose entwickelt. Hinweise aus den genannten
Untersuchungen, die Inaktivierung von CD95 sei möglicherweise durch
Methylierung des Promotors verursacht, sollte in der vorliegenden
Arbeit anhand von gastrointestinalen Karzinomen näher analysiert
werden. Hierzu wurde der Methylierungsstatus von Promotor, Exon 1
und Intron-Enhancer des CD95-Gens von 17 Tumorproben mit
Ras-Mutationen (KRAS2-Mutation in Kodon 12) mittels
methylierungssensitiver Restriktionsenzyme, nachfolgendem
Southernblot und Hybridisierung ermittelt. Bei 16 Tumoren erbrachte
die Restriktionsanalyse für Sma I ein Restriktionsmuster, das eine
Methylierung der Cytosine der CCCGGG-Motive im genannten Bereich
ausschließt. Die nicht geschnittene Sma I-Sequenz in einer
Tumor-DNA (Position 143901) wurde auch für die Normal-DNA
nachgewiesen und erwies sich als RFLP. Ein aufgrund dieses
Ergebnisses postulierter Polymorphismus innerhalb einer Sma I-
Schnittstelle konnte durch Sequenzierung der isolierten Sequenz aus
dem entsprechenden Tumor verifiziert werden. Möglicherweise ist die
Entstehung dieses Polymorphismus zwar die Folge einer ehemaligen
Methylierung des Cytosins in der Konstellation CpG; allerdings
konnte nachgewiesen werden, daß der entsprechende
Nukleotidaustausch nicht im Rahmen der Karzinogenese erfolgt war,
da die DNA aus PBL des gleichen Patienten die identische Sequenz
aufwies. Insgesamt wurde somit für keinen der untersuchten Tumoren
eine Abschaltung der CD95-Expression aufgrund einer Methylierung
des Gens durch aktiviertes, onkogenes Ras festgestellt.