Proteomanalyse von Bartonella henselae: Entwicklung neuer proteombasierter Strategien zur Untersuchung von Pathogenitätsfaktoren von Bartonella henselae

Bartonella henselae ist der Erreger der Katzenkratzkrankheit und
vaskuloproliferativer Erkrankungen des Menschen. Das Bakterium
wurde erstmals 1989 korrekt klassifiziert und den oben genannten
Krankheitsbildern zugeordnet. Es ist ein langsam wachsendes, nicht
in Flüssigmedien kultivierbares Bakterium. Genetische
Untersuchungen sind deswegen schwierig. Im Rahmen dieser Arbeit
wurde daher die zweidimensionale Elektrophorese zur Untersuchung
möglicher Pathogenitätsfaktoren von B. henselae etabliert. Mithilfe
dieser Methode sollte es möglich sein, das gesamte Proteom von B.
henselae unter verschiedenen Kulturbedingungen aufzutrennen und so
Rückschlüsse auf Pathomechanismen dieses Erregers zu ziehen. Die
vorliegende Dissertation lieferte folgende Ergebnisse: 1.
Etablierung eines geeigneten Protokolls zum Aufschluss von B.
henselae für die zweidimensionale Elektrophorese. 2. Erstellung
einer Proteomkarte von auf Agarplatten kultivierten B. henselae.
Hierdurch wurde die Grundvoraussetzung für weitere Proteom-basierte
Studien geschaffen. Zudem wurden drei Proteine (Malatdehydrogenase,
Pyruvatdehydrogenase und DnaK)erstmals bei B. henselae beschrieben.
3. Charakterisierung von vier monoklonalen anti-B.
henselae-Antikörpern mithilfe von zweidimensionalen
Proteom-Western-Blots. Dadurch wurden vier neue B.
henselae–Proteine, unter anderem das Phagenprotein Pap31, als
immunogen in der Maus beschrieben. Zudem wurde hier erstmalig die
zweidimensionale Elektrophorese als schnelle und akkurate Methode
zur Charakterisierung monoklonaler Antikörper eingesetzt. 4. Durch
den Proteomvergleich hitzegestresster und nicht-hitzegestresster B.
henselae wurde gezeigt, dass mit der hier etablierten Methodik
regulative Vorgänge der Proteinsynthese von B. henselae erfasst
werden können. Von den drei identifizierten Hitzestressproteinen
(GroEL, GroES und DnaK) wurde DnaK für B. henselae zum ersten Mal
beschrieben. 5. Zwei pilusassoziierte Proteine (220 kD und 43 kD)
wurden durch Proteomvergleich gefunden. Bei dem in den
zweidimensionalen Auftrennungen sichtbaren 43kD-Protein handelt es
sich um die Phophoserinaminotransferase, ein bakterielles
Stoffwechselenzym. Der Zusammenhang mit der Pilusexpression ist bis
dato unklar. Die Identität dieses Proteins wurde mithilfe reverser
Genetik verifiziert. Das zweite Protein erscheint aufgrund
unterschiedlicher Gelsysteme nur in den eindimensionalen
Auftrennungen und wurde daher im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter
untersucht. 6. Durch die in dieser Arbeit etablierte radioaktive
Markierung von B. henselae-Proteinen mittels 35S-Pulse-Chase wurde
die Untersuchung neu synthetisierter Proteine nach Kokultur mit
humanen Zelllinien ermöglicht. 7. Untersuchung neu synthetisierter
B. henselae-Proteine nach Kokultur des Erregers mit humanen
Endothelzellen mittels 35S-Pulse-Chase. Durch Vergleich mit der
Proteomkarte konnten folgende in der Kokultur neu synthetisierte
Proteine identifiziert werden: die Hitzestressproteine GroES, GroEL
und DnaK, die Stoffwechselenzyme Malatdehydrogenase und
Pyruvatdehydrogenase, der Elongationsfaktor EF-Tu und das
Phagenprotein Pap31. Die Expression von Pap31 bei B. henselae in
Endothelzellkultur wurde hier erstmals gezeigt. Durch die
vorliegende Arbeit wurde eine neue Methode für die weitergehende
Erforschung von B. henselae etabliert, die in Zukunft die
Untersuchung dieses genetisch schwer zugänglichen Organismus
erleichtern wird. Eine Reihe von Proteinen wurde hier für B.
henselae erstmals beschrieben bzw. wurde deren Expression unter
bestimmten Lebensbedingungen zum ersten Mal beobachtet. Die Breite
des methodischen Ansatzes dieser Arbeit legt den Grundstein für
vielfältige weitere Untersuchungen. So konnte zwischenzeitlich die
membranassoziierte Lage von Pap31 mithilfe eines in dieser Arbeit
charakterisierten monoklonalen Antikörper aufgedeckt und
Fibronektin als Bindungspartner von B. henselae–Pili identifiziert
werden.