Diagnostik des Morbus Niemann-Pick Typ A, B und C: Etablierung von Nachweismethoden eines saure Sphingomyelinase-Mangels in verschiedenen humanen Geweben und einer intrazellulären Cholesterintransportstörung in Fibroblasten

Das 1914 als erstes durch Albert Niemann beschriebene, später als
Niemann-Pick-Erkrankung bezeichnete Krankheitsbild, wird zu den
Sphingomyelolipidosen gerechnet und umfasst eine seltene heterogene
Gruppe von autosomal rezessiv vererbten Erkrankungen. Beim Typ A
und B handelt es sich um eine familiär gehäufte, insbesondere in
der jüdischen Bevölkerung auftretende Erkrankung, die durch einen
auf Chromosom 11 liegenden Gendefekt, der eine vermin-derte
ASMase-Aktivität zur Folge hat, bedingt ist. Die ASMase katalysiert
den Abbau des Sphingomyelins zu Ceramid und Phosphocholin. Bei
einem Mangel dieses Enzyms ist die Speicherung von Sphingomyelin im
mononukleären Makrophagensytem vor allem im ZNS, der Milz, Leber
und im Knochenmark charakteristisch. Beim Typ C und D dagegen liegt
eine intrazelluläre Cholesterintransportstörung vor, die durch ein
Fehlen des NPC1- bzw. NPC2-Proteins in den Endo- bzw. Lysosomen
verursacht wird. Der Gendefekt, der zu einer NPC1-Erkrankung führt,
ist auf Chromosom 18 lokalisiert. Da die ursächliche Störung des
Typ D auch auf dem gleichen Chromosom liegt, handelt es sich beim
Typ D um eine allelische Variante des NPC1. Der Gendefekt, der eine
NPC2-Erkrankung bedingt, ist auf Chromosom 14 zu finden. Alle
Subtypen sind durch die pathologische Anhäufung von Cholesterin und
Sphingomyelin in den Lysosomen des ZNS, der Milz und der Leber, die
in den meisten Fällen mit einer sekundär verminderten
ASMase-Aktivität einhergeht, gekenn-zeichnet. Bei der Untersuchung
von Patienten-Gewebezellen mit Verdacht auf Morbus Niemann-Pick
sind wir in mehreren Schritten vorgegangen. Im ersten Schritt
bestimmten wir die ASMase-Aktivität. Dazu verbesserten wir die in
unserem Labor schon mit dem künstlichen Substrat HNP durchgeführte
Aktivitätsbestimmung und führten zusätzlich eine radioisotopische
Methode mit 14C-Sphingomyelin als Substrat ein. Mit beiden Methoden
wurden die kinetischen Eigenschaften des Enzyms und der
Aktivitätsbereich in verschiedenen Geweben und Zellen erarbeitet.
Ein Vergleich der so ermittelten Aktivitäten in
Patientenfibroblasten zeigte bei einem Typ-B-Patienten
radioisotopisch eine Restaktivität von weniger als 10 % und
spektrophoto-metrisch eine im Normbereich liegende Aktivität.
Obwohl beide Methoden einfach und schnell durchführbar sind, ist
die radioisotopische Methode der spektrophotometrischen
vorzuziehen, um das Auftreten falsch negativer Resultate zu
vermeiden. Dies ist durch das bei bestimmten Mutationen entstehende
defekte Enzymprotein mit höherer Substrataffinität zum künstlichen
Substrat und damit falsch hoher Enzymaktivität zu erklären. Von den
in fünf NP-C-Patienten-fibroblasten bestimmten ASMase-Aktivitäten
hatten vier eine partiell verminderte Aktivität. Eine sichere
Diagnose der fünf NPC-Verdachtsfälle wurde durch eine Reihe von
Verfahren, die wir erstmals in unserem Labor etablieren konnten,
ermöglicht. Zunächst erfolgte der Nachweis einer
Cholesterin-Akkumulation in den Lysosomen durch eine
Immunfluoreszenzfärbung mit Filipin, einem Makrolid-Antibiotikum,
das spezifisch 3β-Hydroxysterole bindet. Bei einem positiven
Färberergebnis bestimmten wir die in vitro ASMase-Aktivität. Dazu
wurde durch Kultivierung der Fibroblasten in cholesterinentzogenem
(LPDS = - FBS) bzw. reichem (+ FBS) Medium eine
Cholesterin-Akkumulation simuliert. Mit dieser Methode ist aufgrund
der charakteristischen sekundär verminderten ASMase-Aktivtät in
NP-C-Zellen nach Bebrütung in cholesterinreichem Medium eine sehr
sensitive und spezifische Diagnose pathologischer Zellen möglich.
Eine phänotypische Klassifikation der NP-C-Zellen erforderte die
Durchführung der Oleat-Inkorporationsmethode. Es gelang uns drei
Patienten mit klassischem und zwei mit einem varianten Phänotyp zu
diagnostizieren. Als Letztes bestimmten wir die zytoplasmatische
CEHase-Aktivität in NPD- und Kontrollfibroblasten im leicht
alkalischen Bereich. Erstaunlicherweise lieferte diese Messung eine
verminderte Aktivität in drei NP-C-Fibroblasten, die bisher in der
Literatur nicht beschrieben wurde. Es ist auch keine Erkrankung mit
diesem Enzymmangel bekannt. Deshalb nehmen wir an, dass zusätzlich
zu den Mutationen der NPC-Proteine bei manchen Patienten eine
weitere Mutation entweder auf Chromosom 18 bzw. 14 oder in einem
bisher noch nicht identifizierten Gen liegen muss. Durch die
Etablierung dieser empfindlichen Methoden zur Bestimmung der
ASMase-Aktivität und zum Nachweis einer intrazellulären
Cholesterintransportstörung war es uns möglich, erstmals in unserem
Labor zehn Patienten mit Niemann-Pick Erkrankung, davon zwei Typ A,
drei Typ B und fünf Typ C, mit großer Sicherheit zu
diagnostizieren. Unsere Untersuchungsverfah-ren erwiesen sich als
mit verhältnismäßig geringem Aufwand durchführbar und günstiger als
die bisher durchgeführten Methoden. Zur Diagnosestellung reicht
eine Hautbiopsie in den meisten Fällen aus, so dass den kleinen
Patienten eine invasive Diagnostik erspart werden kann.