Regulation podosomaler Adhäsionen in Makrophagen durch Cofilin-regulatorische Signalwege

Podosomen sind ein prominenter Teil des Aktinzytoskelettes primärer
humaner Makrophagen und wahrscheinlich essentiell für Adhäsion,
Matrixverdau und gerichtete Migration. In der vorliegenden Arbeit
wurde die Regulation dieser Strukturen untersucht. Es konnte
zunächst gezeigt werden, dass Monozyten Podosomen nicht nur auf
starren, künstlichen Oberflächen wie Glas-Deckgläschen ausbilden,
sondern auch auf einem Monolayer aus Endothelzellen. Dies
unterscheidet sie klar von anderen Adhäsionsstrukturen wie z.B.
focal adhesions. Auch in verschiedenen Zelllinien, unter anderem in
Krebszellen, ließen sich podosomale Strukturen nachweisen bzw.
induzieren. Diese Befunde sind Hinweis einerseits auf die
physiologische Relevanz von Podosomen und andererseits auf eine
wahrscheinlich weite Verbreitung dieser Strukturen in verschiedenen
Zelltypen. Podosomen sind hochdynamische Strukturen mit einer
Halbwertszeit von 2-12 Minuten, das heißt, es werden permanent
Podosomen abgebaut und neu gebildet. Dazu ist die Polymerisation
und Depolymerisation von filamentösem (F-)Aktin notwendig.
Regulationsmechanismen F-Aktin-aufbauender Wege sind gut untersucht
und bekannt, weshalb in der vorliegenden Arbeit F-Aktin-abbauende
Wege untersucht wurden. Ein wichtiger Regulator des
Aktinzytoskelettes ist Cofilin, das die Depolymerisierung von
Aktinfilamenten beschleunigt und unter anderem durch
Phosphorylierung am Serin-3 inaktiviert werden kann. Folgende
Ergebnisse sprechen für eine wichtige Rolle von Cofilin in der
Podosomen-Regulation: Es konnte eine spezifische Lokalisation von
Cofilin und phosphoryliertem Cofilin in der Aktin-reichen
Podosomen-Kernstruktur nachgewiesen werden. Im Western Blot zeigte
sich eine Korrelation des Grades der Cofilin-Phosphorylierung mit
der Podosomenanzahl. Durch Mikroinjektion eines kurzen Peptids,
welches die Cofilin-Phosphorylierung inhibiert, sowie durch
Transfektion von Cofilin-siRNA konnte die Podosomen-Bildung
reduziert werden. Die am besten untersuchten Cofilin-Kinasen sind
die LIM-Kinasen 1 und 2. Mittels RT-PCR war in unserer
Arbeitsgruppe bereits die Expression von LIMK1 in Makrophagen
nachgewiesen worden. Auch Ergebnisse im Western Blot sowie in
DNA-Arrays weisen auf LIMK1 als dominante Isoform in Makrophagen
hin. In fixierten Präparaten konnte allerdings weder mit
kommerziell erhältlichen noch mit einem selbst hergestellten, gegen
die LIM-Domänen von LIMK1 gerichteten Antikörper eine spezifische
Lokalisation von LIMK1 an Podosomen nachgewiesen werden. Mittels
Nucleofection wurden deshalb verschiedene LIM-Kinase-Konstrukte
transfiziert und überexprimiert. Dabei bestätigten sich die
Ergebnisse der Antikörperfärbungen, keines der Konstrukte war in
Podosomen zu finden. Alle Konstrukte mit Kinase-Aktivität führten
zum raschen Krampfen und Ablösen der Zellen, wobei die
Adhäsionsfläche bis zuletzt mit Podosomen bedeckt war. Im Gegensatz
zu den Befunden aus der Transfektion war durch Mikroinjektion der
konstitutiv aktiven Kinase-Domäne von LIMK1 eine deutliche
Reduktion der Podosomen-Bildung zu erzielen. Hier können
konzentrationsabhängige Effekte eine Rolle spielen. Als
Gegenspieler der LIM-Kinasen wurden die Phosphatasen PP1 und PP2A
beschrieben. Eine spezifische Lokalisation von PP2A an Podosomen
war jedoch nicht nachzuweisen, zudem hatte eine Inhibition der
beiden Phosphatasen keinen Effekt auf die Podosomenbildung oder den
Podosomenabbau. Dies spricht gegen eine Beteiligung von PP1 oder
PP2A an der Podosomenregulation. LIM-Kinasen selbst können durch
Effektoren der Rho-GTPasen Rho, Rac und Cdc42 reguliert werden. So
aktiviert der Rho-Effektor ROCK LIMK1 und LIMK2. Der ROCK-Inhibitor
Y?27632 führte zu einer Störung der Podosomen-Verteilung, auch die
Podosomen-Neubildung wurde stark inhibiert. Dies spricht für eine
Beteiligung von ROCK an der Podosomenregulation. Auch Rac und Cdc42
können durch die gemeinsamen Effektoren der PAK-Familie eine
Aktivierung von LIMK1 bewirken, dabei sind PAK1 und PAK4 die am
besten untersuchten Isoformen. Die Transfektion verschiedener PAK1-
und PAK4-Konstrukte führte jeweils zu einer Reduktion der
Podosomen-Anzahl, unabhängig von der Kinase-Aktivität des
Konstruktes. Die Kinase-inaktive PAK4-Mutante führte zu einer
Reduktion des F-Aktin mit kleinen Podosomen, während die
konstitutiv-aktive PAK4-Mutante große Podosomen mit vermehrtem
F-Aktin bewirkte. Weitere Arbeiten zur Untersuchung vor allem von
PAK4 in unserer Arbeitsgruppe konnten diese Ergebnisse bestätigen
und quantifizieren sowie weitere Interaktionspartner nachweisen.
Eine weitere Regulationsmöglichkeit von Cofilin ist die Bindung des
second messengers PIP2, welcher unter anderem durch Isoformen der
Phospholipase C (PLC) hydrolysiert werden kann. Die Mikroinjektion
zweier Peptide, die laut Literatur zu einer PIP2-Inhibition bzw.
einer Steigerung des PIP2-Abbaus führen, hatte keinen Einfluss auf
Podosomen. Durch Transfektion der PH-Domäne von PLCd1, welche als
PIP2-Sensor eingesetzt werden kann, konnte jedoch eine teilweise
Lokalisation von PIP2 an Podosomen gefunden werden. Mit
spezifischen Antikörpern konnte zudem eine Lokalisation von PLCb1
im Aktin-reichen Podosomenkern und von PLCb2 in der podosomalen
Ringstruktur nachgewiesen werden, PLCb3 zeigte keine spezifische
Lokalisation. Auch ein PLCb2-Konstrukt reicherte sich nach
Transfektion in der podosomalen Ringstruktur an. Der PLC-Inhibitor
U-73122 führte zu einem kompletten Verschwinden der Podosomen mit
nachfolgender Ablösung der Zellen. Aufgrund dieses Befundes und der
spezifischen Lokalisation ist von einer Beteiligung der PLCb1 und
PLCb2 in der Podosomen-Regulation auszugehen. Im Rahmen der
vorliegenden Arbeit konnten somit wichtige Effektoren der
podosomalen Aktinregulation identifiziert werden: Cofilin als
direkter Interaktionspartner von Aktin, LIMK1 als Cofilin-Regulator
sowie ROCK und PAK als upstream-Regulatoren in der Signalkaskade.
Darüber hinaus scheinen PLCb1 und PLCb2, möglicherweise über PIP2,
ebenfalls an der Podosomen-Regulation beteiligt zu sein. Dies legt
die Grundlage für weitere Untersuchungen über die molekularen
Mechanismen der podosomalen Aktinregulation.