Knochenzellwachstum im dreidimensionalen Zellkultursystem

Zielsetzung und Fragestellung: Bei der Behandlung von
Knochendefekten wird dem Tissue Engineering großes Potential
zugesprochen. In der vorliegenden Untersuchung wurden humane
Mesenchymale Stammzellen (hMSC) in vitro vermehrt und unter
osteogener Stimulation auf einer bereits klinisch zur
Knochendefektfüllung zugelassenen Leitschiene kultiviert. Ziel der
Arbeit war neben der Etablierung des Modells zunächst die
qualitative Beurteilung des Zellwachstums über Zeiträume von 2, 4
und 6 Wochen. Insbesondere aber sollte der immunhistochemische
Nachweis von Zelldifferenzierung und Matrixbildung im
dreidimensionalen System im Vergleich zur zweidimensionalen Kultur
über einen Zeitraum von 2 Wochen erfolgen, und damit die
Untersuchung des Einflusses der Dreidimensionalität der gewählten
Leitschiene. Material und Methoden: Die Vermehrung der hMSC (Fa.
Poietics) erfolgte in DMEM unter Zugabe von FBS, L-Glutamin und
Antibiotika. Die zylinderförmigen Leitschienen (Tutobone, Fa.
Tutogen Medical, d= 9 mm, h= 3 mm) wurden mit jeweils 1,6 Mio.
Zellen besiedelt. Die Kultivierung erfolgte im Bioreaktor für 2, 4
und 6 Wochen bei kontinuierlicher Mediumversorgung (3,3 ml/h). Zur
osteogenen Stimulation wurde Dexamethason, Ascorbinsäure-2-Phosphat
und beta-Glycerophosphat zugesetzt. Für die 2-D-Vergleichsgruppen
wurde ein Teil der Ausgangszellen mit, ein weiterer Teil ohne
osteogene Stimulation für 2 Wochen fortgeführt. Nach 2, 4 und 6
Wochen erfolgte die auflichtmikroskopische, histologische und
immunhistochemische Auswertung aller Präparate. Alle Versuche
wurden dreifach durchgeführt, die Kulturen über 4 Wochen einfach.
Ergebnisse: Innerhalb der Leitschienen konnte in allen
Versuchszeiträumen homogenes, dreidimensionales Zellwachstum sowie
deutliche Matrixbildung gezeigt werden. Die immunhistochemischen
Nachweise für Prokollagen I, Kollagen I und IV, Osteocalcin,
Osteonectin, und Versican waren in den 3-D-Präparaten in allen
Zeiträumen deutlich positiv, die Nachweise für Alkalische
Phosphatase und Decorin negativ. Im Vergleich zu den 3-D-Kulturen
war in der stimulierten 2-D-Kultur die Markierung von Osteocalcin
deutlich schwächer ausgeprägt. Ohne osteogene Stimulation konnten
in den 2-D-Kulturen positive Nachweise für Kollagen I, Kollagen IV,
Osteonectin, Prokollagen I und Versican gefunden werden, keine
Nachweise für Alkalische Phosphatase, Decorin und Osteocalcin.
Schlussfolgerungen: 1. Die dreidimensionale Kultivierung von
humanen MSC in vitro in Verbindung mit der gewählten Leitschiene
und unter kontinuierlicher Mediumversorgung ist über Zeiträume bis
zu 6 Wochen möglich. 2. In allen Versuchszeiträumen führte dies
bereits nach qualitativen Gesichtspunkten zu ausgeprägtem
dreidimensionalem Zellwachstum. 3. Als Zeichen osteogener
Differenzierung fällt der Nachweis des osteoblastentypischen
Markers Osteocalcin in den 3-D-Kulturen im Vergleich zu den
2-D-Kulturen deutlich positiv aus. Dreidimensionales Zellwachstum
in vitro stellte unter den gewählten Bedingungen einen zusätzlichen
Stimulus für die osteogene Differerenzierung dar. 4. Alkalische
Phosphatase, Decorin, Prokollagen I, Kollagen I und IV, Osteonectin
und Versican eigneten sich in der vorliegenden Untersuchung nicht
als spezifische Marker der osteoblastären Kaskade.