Untersuchung der Interaktion von Makrophagen mit dem humanpathogenen Hefepilz Candida albicans: Toll-like Rezeptoren und NF-кB Aktivierung

Der opportunistisch humanpathogene Hefepilz Candida albicans gehört
bei vielen gesunden Menschen zur mikrobiellen Schleimhautflora,
kann jedoch bei abwehrgeschwächten Patienten oberflächliche
Infektionskrankheiten sowie lebensbedrohliche Organmykosen
verursachen. Obwohl der Immunstatus des Wirtes für eine Infektion
mit diesem Erreger von entscheidender Bedeutung ist, trägt auch
eine Reihe von Virulenzfaktoren, insbesondere die sekretorischen
Aspartatproteasen (Saps), zur Pathogenität von C. albicans bei. Die
angeborene Immunität ist in der Lage, derartige Pathogene schon
beim Erstkontakt zu erkennen und zu bekämpfen. Haupteffektoren
dieser schnellen, angeborenen Immunantwort sind Makrophagen und
neutrophile Granulozyten. Mitglieder der Toll-Proteinfamilie,
sogenannte Toll-like Rezeptoren (TLRs), wurden kürzlich als
Rezeptoren auf diesen Immunzellen in Säugern identifiziert. Sie
erkennen unterschiedliche Erreger anhand von in der Evolution hoch
konservierten Strukturen, den Pathogen-assoziierten molekularen
Mustern (PAMPs), was zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors
NF-кB und zur Freisetzung von Zytokinen führt. Sowohl TLR2 als auch
TLR 4 wurden kürzlich für die Erkennung von C. albicans diskutiert.
Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Interaktion von Makrophagen
mit C. albicans im Hinblick auf die Aktivierung von Toll-like
Rezeptoren und die nukleäre Translokation von NF-кB zu untersuchen.
Neben dem lebenden C. albicans-Isolat wurden zudem drei weitere
Präparationen untersucht: Mit den Antimykotika (AM) Amphotericin B,
Nystatin und Itraconazol vorbehandelte Keime, durch Hitze
inaktivierte Keime sowie Sap-inaktivierte Keime. Die
Zellstimulationsexperimente wurden mit murinen Wildtyp-Makrophagen,
TLR2- bzw. TLR4- defizienten Einzelknockoutmutanten und mit
TLR2/4-Doppelknockoutmutanten durchgeführt. Die TLR-vermittelte
Aktivierung von NF-кB wurde mit Gelshifts (EMSA) nachgewiesen. Mit
Western Blots wurden die intrazellulären Signaltransduktionswege
untersucht. Der Hitze-inaktivierte Stamm bewirkte keine
Translokation von NF-кB in Wildtyp-Makrophagen. Eine Inhibition der
Saps bewirkte keine Abschwächung der NF-кB Induktion, so dass im
Umkehrschluss dieser bedeutende Virulenzfaktor die TLR-vermittelte
NF-кB Aktivierung nicht beeinflusst. Der lebende Stamm benutzte
sowohl TLR2 als auch TLR4 für die Induktion von NF-кB. Nach
Vorstimulation der Makrophagen mit Interferon-γ ließ sich jedoch
eine klare TLR2-Abhängigkeit – unabhängig von TLR4 – in der
Aktivierung von NF-кB und in der Induktion von TNF-α zeigen. In
beiden Fällen wurden die Makrophagen erst ab einer Candida-Dichte
von 106 Zellen pro 100 µl PBS stimuliert. Für den AM-vorbehandelten
Stamm ergab sich eine deutliche TLR2-Abhängigkeit in der Regulation
von NF-кB, welche durch die Präinkubation der Makrophagen mit IFN-γ
nicht beeinflusst wurde. AM-vorbehandelte Keime konnten NF-кB in
den Makrophagen erst ab einer Dichte von 107 Zellen pro 100 µl PBS
aktivieren. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass lebende
und AM-vorbehandelte Keime im Gegensatz zur Hitze-inaktivierten
Präparation und zu den Saps relevante PAMP-Strukturen für eine
TLR-vermittelte NF-кB Hochregulation besitzen. Die Beteiligung
beider Rezeptoren, TLR2 und TLR4, belegt beim lebenden Stamm das
Konzept, dass immunkompetente Zellen sich mehrerer TLRs bedienen,
um die Immunantwort möglichst spezifisch und fein zu regulieren.
Beim AM-vorbehandelten Stamm scheint den Antimykotika Amphotericin
B, Nystatin und Itraconazol eine besondere Rolle zuzukommen, da
diese die Integrität der Pilzmembran stören und somit
TLR2-aktivierende PAMPs aus Zellwand und/oder Zytosol freisetzen.
Neben dem direkten Effekt auf die Pilzmembran kommt es somit
zusätzlich zu einer indirekten, TLR2 vermittelten Stimulation der
Makrophagen. Untersuchungen der Signaltransduktion (Stimulation von
Wildtyp-Makrophagen mit dem AM-vorbehandelten C. albicans-Isolat)
ergaben eine vorübergehende, zeitlich eng begrenzte Induktion von
NF-кB, die durch den Inhibitor IкB-α reguliert wird. Gleichzeitig
wurden im zeitlichen Verlauf der Stimulation auch MAP Kinasen (ERK,
p38, JNK) und c-Jun, eine Subeinheit des Transkriptionsfaktors
AP-1, phosphoryliert. Diese simultane Aktivierung beider
Transkriptionsfaktoren weist auf eine feinregulierte Immunantwort
der Makrophagen gegenüber C. albicans hin und legt zudem einen
Cross-Talk zwischen NF-кB und AP-1 nahe.