Untersuchungen zur Funktion von WASp (Wiskott-Aldrich Syndrom Protein) bei der Regulation der Aktin Nukleation in vitro und in primären humanen Makrophagen

Die Polymerisation von monomerem G-Aktin zu filamentösem F-Aktin,
die Organisation von Aktin-Filamenten zu spezifischen
Zytoskelettstrukturen, sowie die F-Aktin Depolymerisation stellen
in ihrem dynamischen Zusammenspiel die Triebkraft vieler zellulärer
Bewegungsvorgänge dar. Dies sind u.a. Zell-Polarisation,
Zell-Migration, Zell-Teilung, Zell-Zell-Interaktionen, Phagozytose
und intrazellulärer Vesikeltransport. Das Verständnis der
molekularen Grundlagen der Aktin Organisation hat 1999 einen
entscheidenden Fortschritt gemacht: damals wurde entdeckt, dass der
sieben Untereinheiten umfassende Arp2/3 Komplex nach Aktivierung
durch Proteine der Wiskott-Aldrich Syndrom Protein- (WASp-) Familie
Aktin-Filamente de novo polymerisieren kann. Die Experimente für
diese Dissertationsarbeit hatten zum Ziel, den Mechanismus der
WASp-abhängigen Aktin Nukleation in vitro und in humanen
Makrophagen genauer zu untersuchen. Einerseits sollten die Regionen
von WASp genauer charakterisiert werden, die für die Aktivierung
des Arp2/3 Komplexes verantwortlich sind. Andererseits sollte die
Bedeutung von WASp und Arp2/3 Komplex bei der Aktin Nukleation in
spezialisierten Adhäsionsstrukturen von Makrophagen, sogenannten
Podosomen, geklärt werden. Podosomen sind essentiell für Adhäsion,
Migration und vermutlich auch Gewebeinvasion von Makrophagen und
ihnen verwandten Zellarten, aber sie finden sich auch in einer
Vielzahl weiterer Zelltypen einschließlich metastasierender
Tumorzellen. Die Bedeutung von Podosomen wird dadurch verdeutlicht,
dass ihr Fehlen bei unter Wiskott-Aldrich Syndrom leidenden
Patienten mit klinisch relevanten Immundefekten assoziiert ist. Zur
Identifizierung der für die Aktin Nukleation minimal notwendigen
WASp Regionen wurden verschiedene GST-Fusionskonstrukte der
konstitutiv aktiven VCA (“Verprolin-like“, “Central“, “Acidic“)
Domäne hergestellt. Durch Anisotropie Messungen und in
GST-“Pulldown“ Versuchen wurde die Bindung von Arp2/3 Komplex und
G-Aktin an die verschiedenen Konstrukte in vitro bestimmt. In einem
zweiten Schritt wurde getestet, welche Regionen für die Arp2/3
Komplex Aktivierung notwendig sind. Dabei wurde GST-VC als die
minimal notwendige Region für die Aktivierung der Aktin Nukleation
identifiziert. Durch mikroskopische Analyse von in vitro
nukleierten Aktin-Filamenten stellten wir fest, dass der durch
GST-VC aktivierte Arp2/3 Komplex auch zur Ausbildung von
Aktin-Filament Verzweigungen fähig ist. Die zellulären Effekte der
VCA Konstrukte wurden mittels Mikroinjektion in primäre humane
Makrophagen untersucht. Aktive Konstrukte führten zum Auftreten von
prominenten Aktin-Aggregaten im Zytoplasma und zur Zerstörung von
Podosomen. Auch hierbei war GST-VC das kürzeste Konstrukt, das
vermutlich durch Aktivierung von zellulärem Arp2/3 Komplex, zur
Zunahme des Gehaltes an intrazellulärem polymerisiertem Aktin
führte. Obwohl die WASp-A Region als hochaffine Arp2/3 Komplex
Bindungsstelle beschrieben worden war (Machesky und Insall, 1998),
ist sie für die Arp2/3 Komplex Aktivierung nicht essentiell. Durch
Koinjektion von WASp-A oder N-WASP-A mit aktiven GTPasen konnte ein
erster experimenteller Hinweise für eine “Priming“-
(Sensibilisierungs-) Funktion der A Region am Arp2/3 Komplex
gefunden werden. Bei der Untersuchung der Aktin Nukleation und
Organisation in Podosomen zeigte sich ein enger funktioneller
Zusammenhang zwischen Aktin- und Tubulin-Zytoskelett. So konnte
durch Depolymerisierung der Mikrotubuli in adhärierenden Monozyten
die Ausbildung von Podosomen verhindert werden. Da bekannt war,
dass WASp über seine Polyprolin Domäne an CIP4 (“CDC42 Interacting
Protein“) bindet und dieses wiederum mit Mikrotubuli assoziiert,
wurde der Einfluss der isolierten WASp-Polyprolin Domäne, aber auch
von CIP4 Deletions-Konstrukten, denen entweder die Mikrotubuli oder
WASp Bindungsstelle fehlten, auf die Podosomen-Ausbildung
untersucht. Einem auf den so erhaltenen Ergebnissen basierendem
Modell zufolge könnte WASp durch CIP4 an Mikrotubuli rekrutiert und
anschließend via Mikrotubuli an Orte der Podosomen-Bildung
transportiert werden. Dort könnte WASp dann zur Aktivierung von
Arp2/3 Komplex und zur Nukleation von neuen Aktin-Filamenten
führen.