Entwicklung eines Modells zur Testung der Genotoxizität von Umweltstoffen anhand von Miniorgankulturen humaner nasaler Mukosazellen

Umwelt- und Arbeitsstoffe stellen wichtige Faktoren bei der
Kanzerogenese im menschlichen Körper dar. In der vorliegenden
Arbeit wurden einige Vertreter von Umweltstoffen ausgewählt und auf
ihre kanzerogene Wirkung hin untersucht: N-Nitrosodiethylamin
(NDEA) für die Nitrosamine, Natriumdichromat (Na2Cr2O7) für die
Chromverbindungen, Mono(2-Ethylhexyl)-Phthalat (MEHP) für die
Phthalate und Benzo[a]pyren-Diolepoxid (BPDE) für die
polyzyklischen Kohlenwasserstoffe. Als Negativkontrolle diente
Dimethylsulfoxid (DMSO) und als Positivkontrolle
N-Methyl-N‘-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG). Da viele dieser Stoffe
über die Atemwege aufgenommen werden, ist die Schleimhaut des
oberen Aerodigestivtraktes besonders exponiert. Als
Untersuchungsmaterial diente deshalb humane nasale Schleimhaut. Um
möglichst lebensnahe Bedingungen zu schaffen, wurden aus dieser ca.
1mm3 große Miniorgane gewonnen, die über eine Woche kultiviert
wurden, was zu einer vollständigen Epithelialisierung führte. Die
im natürlichen Zellverband verbliebenen Zellen konnten daraufhin
mehrmals mit Fremdstoffen inkubiert werden. Die dazwischenliegenden
Zeitintervalle ließen Reparaturvorgänge zu. Die Schädigungsmuster
von Miniorganzellen wurden auch mit denen von Einzelzellen
verglichen, die vor der Inkubation separiert worden waren. Dabei
wurden sowohl Einzelzellen aus Frischbiopsaten und als auch
Einzelzellen aus Miniorganen nach 7-tägiger Kultivierung getestet.
Zur quantitativen Schädigungsanalyse wurde die alkalische
Einzelzell-Mikrogelelektrophorese (Comet Assay) angewandt, bei der
es zu einer Wanderung von gelösten DNA-Bruchstücken im elektrischen
Feld kommt. Diese Wanderung konnte durch anschließende Anfärbung
unter dem Fluroszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Die
Ergebnisse zeigten unterschiedliche Fragmentierungen der DNA nach
einmaliger und dreimaliger Fremdstoffinkubation: Die
DNA-Schädigungen der Miniorgane blieben nach ein- und dreimaliger
Inkubation mit NDEA und MEHP auf gleichem Niveau. Dagegen traten
bei jeder Inkubation mit Na2Cr2O7, BPDE und MNNG zunehmende
DNA-Fragmentierungen auf. Die aus Frischbiopsaten gewonnenen
Einzelzellen zeigten bei jeder der getesteten Substanzen eine
erhöhte Empfindlichkeit. Der direkte Vergleich zwischen
Einzelzellen und Miniorganen nach 7 Tagen ergab eine gleich hohe
Schädigung für NDEA. Bei den anderen getesteten Stoffen wiesen die
Einzelzellen höhere DNA-Fragmentierungen auf. Es konnte gezeigt
werden, dass alle getesteten Stoffe Schädigungen an der Erbsubstanz
in Form von Einzelstrangbrüchen hervorrufen. Im Vergleich zwischen
Miniorganen und Einzelzellen wiesen Einzelzellen überwiegend eine
höhere Empfindlichkeit gegenüber Fremdstoffen auf als die im
epithelialen Strukturverband belassenen Zellen der Miniorgane. Das
Miniorganmodell bot mehrfache Inkubationsmöglichkeiten und ließ so
Reparaturphasen zu. Durch die Verwendung von Miniorgankulturen
können lebensnahe Bedingungen geschaffen werden, die die Vorgänge
im menschlichen Körper besser widerspiegeln als ein
Einzelzellmodell. Die Verwendung von Miniorgankulturen eignet sich
somit zur Untersuchung der metabolischen Kompetenz von Zellen und
der DNA-Reparaturmechanismen. Dadurch kann die hier vorgestellte
Methode zur Prävention von malignen Tumoren des oberen
Aerodigestivtraktes einen wichtigen Beitrag leisten. Auch die hier
erstmals in Verbindung mit Miniorganen eingesetzte alkalische
Einzelzell-Mikrogelelektrophorese (Comet Assay) erwies sich als
geeigneter Kurzzeittest zur Schädigungsanalyse. Das gezeigte Modell
ermöglicht die Weiterentwicklung einer Screeningmethode für die
Genotoxizität von Umweltstoffen unter Berücksichtigung
individueller Empfindlichkeiten.