Vergleichende funktionelle und molekulare Charakterisierung humaner Zelllinienmodelle aus dem Knochenmark und dem peripheren Blut bezüglich deren Stammzellpotenz und Plastizität

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen und
molekularen Charakterisierung von humanen CD34- Zelllinien aus dem
peripheren Blut (V54/1, V54/2) im Vergleich zu den aus dem
Knochenmark etablierten Zelllinien (L87/4, L88/5). Die Klone V54/1
und V54/2 wurden aus dem peripheren Blut nach
Stammzellmobilisierung und CD6 Depletion durch Zugabe eines
Faktorengemisches aus IL-1b, IL-3, IL-6, IL-7, IL-8 und IL-11
erzeugt. L87/4 und L88/5 hingegen sind adhärente und
wachstumsarretierte Stromazellen, die die Erhaltung und
Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen durch
Mediatoren ermöglichen (Thalmeier et al. 2000). Das Ziel dieser
Arbeit war die Untersuchung von Stammzelleigenschaften bei den
Zelllinien L87/4, L88/5, V54/1 und V54/2. Dazu soll die Färbung mit
den Farbstoffen Rhodamin 123 (Rh123) und Hoechst 33342 zeigen, ob
Subpopulationen innerhalb der Klone mit unterschiedlichen
Färbeeigenschaften, bestehen. Die biologische Bedeutung der beiden
Farbstoffe liegt darin, dass Sie dazu geeignet sind frühe
Stammzellen zu identifizieren. Als Substrat der
P-Glykoproteinpumpe, die u.a. auf frühen Vorläuferzellen mit stark
erhöhter Repopulationskapazität gefunden wird, werden diese
Farbstoffe aus der Zelle gepumpt. Der Farbstoff-Efflux kommt durch
die mdr-Gen-kodierte (multi-drug-resistance) und Kalzium-abhängige
P-Glykoproteinpumpe zustande. Das P-Glykoprotein hat neben der
Bedeutung in der Stammzellbiologie in der angewandten Medizin eine
wichtige Funktion in der Resistenzentwicklung von Tumoren. Des
weiteren wurden bei den Zelllinien stammzellrelevante
Oberflächenantigene (CD10, CD34, CD14, CD105, SH3 und CD117)
untersucht, um Unterschiede zwischen L87/4, L88/5 und den Klonen
V54/1, V54/2 zu erkennen. Versuche zur Induktion der
Differenzierung sollten Hinweise auf die Plastizität der Zelllinien
geben. Experimente an den durch den Rh123-Efflux unterscheidbaren
Subpopulationen der Zelllinie V54/2 dienen der Aufklärung von
Unterschieden in Morphe, zellulären Transportfunktionen und
Funktionseinheiten von Transkriptionsfaktor Netzwerken. Methodisch
wurde für die Analyse der Epitope und der Färbungen mit Rh123 und
Hoechst 33342 ein Durchflußzytometer verwendet. Die Analyse der
Funktionseinheiten von Transkriptionsfaktor Netzwerken wurde
mittels Reverse Transkriptase Polymerase Ketten Reaktion
durchgeführt. Die Ergebnisse der Färbeexperimente zeigten, dass bei
allen untersuchten Zelllinien durch eine unterschiedliche
Anfärbbarkeit der Zellen mit dem Farbstoff Rh123 zwei
Subpopulationen unterschieden werden können. Die jeweils größere
Subpopulation der Zelllinien färbt sich mit Rh123 an und bleibt
auch nach einer definierten Inkubationszeit, die den Rh123-Efflux
ermöglichen soll, gefärbt. Sie wird Rh123high genannt. Die übrigen
Zellen, die bei allen Zelllinien unter 10% der Gesamtpopulation
betragen, sind in der Lage den Farbstoff aus der Zelle zu pumpen.
Diese Subpopulation wird Rh123low genannt und ist mit
Stammzelleigenschaften wie tausendfach erhöhter
Repopulationsfähigkeit in NOD/SCID-Mäusen assoziiert. Es konnte
also innerhalb der untersuchten monoklonalen Linien eine Rh123low
Subpopulation identifiziert werden, die sich durch zahlreiche
biologische Eigenschaften von der Gesamtpopulation unterscheidet.
Da der Rh123 Efflux durch eine Kalzium-abhängige Pumpe zustande
kommt, lässt sie sich durch den Kalziumantagonisten Verapamil
hemmen. Eine Hemmung der Pumpe bewirkt, dass die Rh123low Zellen
nicht mehr in der Lage sind Rh123 aus der Zelle zu pumpen, so dass
sie nach einer definierten Inkubationszeit mit Rh123 gefärbt
bleiben. Neben diesem funktionellen Beweis für die
P-Glykoproteinpumpe konnte durch den strukturellen Nachweis der
Pumpe mittels eines Antikörpers gegen P-Glykoprotein ein
definitiver Beweis für das Vorhandensein der aktiven
P-Glykoproteinpumpe bei der Rh123low Population erbracht werden.
Mit dem anderen Farbstoff Hoechst 33342 können die jeweiligen
Anteile der Zelllinien in den einzelnen Stadien des Zellzyklus
nachgewiesen und zudem ein kleiner Anteil an Zellen bestimmt
werden, der als „Side Population“ (SP-Zellen) definiert wird.
Diesen SP-Zellen werden Eigenschaften von aktiven Stammzellen
zugeschrieben. Hierbei besteht ein Unterschied zwischen den aus dem
Knochenmark und den aus dem peripheren Blut etablierten Linien, da
die Zellen aus dem peripheren Blut nicht nur ein anderes
Zellzyklusmuster aufweisen, sondern auch einen höheren Anteil an
SP-Zellen besitzen. Es wurden vergleichende Untersuchungen zwischen
den Zelllinien und zwischen den Rh123high und Rh123low
Subpopulationen innerhalb einer Zelllinie mit Antikörpern gegen die
Epitope CD14, CD45, HLA-DR, CD10, CD117, CD105 und SH3
durchgeführt. Dabei waren CD14 und CD45 auf allen Zelllinien
negativ, wobei alle Zelllinien eine positive Expression für den
mesenchymalen Marker Endoglin (CD105) und für SH3 (CD73) zeigten.
CD117 konnte nur auf den aus dem Knochenmark etablierten Zelllinien
L87/4 und L88/5 nachgewiesen werden. CD34, ein charakteristischer
Marker für hämatopoetische Vorläuferzellen, aber auch für
Endothelzellen, konnte nur auf den Zellen der Rh123low
Subpopulation nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu exprimieren
die Rh123high Zellen kein CD34. Da es sich bei den Zelllinien um
Klone handelt, ist der Unterschied in der Expression von CD34
zwischen der Rh123low und der Rh123high Population ein deutlicher
Hinweis auf die Plastizität der Zelllinien und das
Fließgleichgewicht zwischen Rh123low und Rh123high. Durch eine
Zellsortierung der Zelllinie V54/2 wurde die Rh123low von der
Rh123high Subpopulation getrennt, um sie dann bezüglich ihrer
Morphologie, dem Wachstum in Methylzellulose und der Expression
ausgewählter Funktionseinheiten von Transkriptionsfaktor Netzwerken
zu untersuchen. Dabei erhärtete sich die Hypothese, dass es sich
bei der Rh123low Subpopulation um aktivere Zellen mit einer
gesteigerten Expression von erythroid/myeloischen und mesodermalen
Eingaben (z.B. VEGF, BMP-4), Rezeptoren (z.B. tie-1), vernetzter
Transkriptionsfaktoren (z.B. GATA, ETS) und letztendlich Ausgaben
(z.B. PECAM) handelt. Diese fungieren in Netzwerken mit dem Ziel,
stammzellrelevante Funktionen zu ermöglichen. Die Morphologie
zeigte in den Zytozentrifugationspräparaten deutliche Unterschiede
zwischen Zellen der Rh123low und der Rh123high Subpopulation. Die
Rh123low Subpopulation besteht aus lymphoid-ähnlichen Zellen, was
für Zellen mit Stammzellfunktion charakteristisch ist. Die
Rh123high Subpopulation dagegen hat ein insgesamt größeres
Zellvolumen und einen gebuchteten Kern mit perinukleärer
Aufhellung. Untersuchungen des klonalen Wachstums in der
Methylzellulose ergaben bei keiner der Subpopulationen eine
wesentliche Koloniebildung. Durch die Inkubation der Zelllinie
V54/2 mit dem Neurotropen Wachstumsfaktor (NGF) konnte eine
morphologische Änderung in Richtung einer neuronalen/glialen
Differenzierung nach 8-12 Stunden induziert werden. Der
immunhistochemische Nachweis von Glial Fibrillary Acidic Protein
(GFAP) bestätigte die mesenchymale Potenz zumindest in Richtung
einer glialen Differenzierung. Das unterschiedliche
Expressionsmuster ausgewählter, für die Differenzierung notwendiger
Zusammenspieler innerhalb von Transkriptionsfaktor Netzwerken
innerhalb der Rh123high und der Rh123low Population bei V54/2 war
ein weiterer Hinweis, dass es sich bei der Rh123low Subpopulation
um aktive Vorläuferzellen mit möglicher Stammzellpotenz handelt. In
der Rh123low Subpopulation wurde im Gegensatz zur Rh123high
Population eine Expression von BMP4, GATA1, GATA3 nachgewiesen, die
essentiell für die Hämatopoese und für eine mesenchymale
Differenzierung ist. Die Faktoren für GATA2, GATA3, beta globin,
Elf-1 und PECAM1 wurden in einem stärkeren Maß in der Rh123low als
in der Rh123high Population exprimiert. BMP-Rez., Myb, sowie die
Endothel-assoziierten Faktoren Tie-1 und VEGF waren in beiden
Subpopulationen gleich stark vorhanden. Bei den wenigen
Funktionseinheiten der größeren und Rh123high Population handelt es
sich vor allem um angiogenetische Faktoren, was auf eine limitierte
Differenzierungseigenschaft der Rh123high Subpopulation und die
enge Beziehung zwischen Blut- und Endothelzellen („Hämangioblast“)
hinweist. Ein Nachweis für die Plastizität der Stammzellen
innerhalb der von uns etablierten Zelllinien wurde dadurch
erbracht, dass die zellsortierten Subpopulationen Rh123low und
Rh123high nach dem Sortierexperiment getrennt rekultiviert wurden,
wobei das Wachstum der Rh123low Subpopulation deutlich langsamer
war als das der Rh123high Subpopulation. Nach zwei Wochen wurden
die zellsortierten Subpopulationen erneut einer Rh123 Färbung
unterzogen, wobei sich wiederum das ursprüngliche Verhältnis
zwischen den Rh123low und Rh123high Subpopulationen einstellte. So
kann man aus der Transdifferenzierung der Zelllinien von Rh123low
in Rh123high und umgekehrt die Plastizität der hier untersuchten
adulten Stammzelllinien ableiten. Die Ergebnisse sollen zum
grundlegenden Verständnis der Biologie adulter (nicht embryonaler)
Stammzellen beitragen und damit die Möglichkeit schaffen, adulte
Stammzellen bzw. deren Subpopulationen gezielt für einen
reparativen Gewebe- und Organersatz zu verwenden. Dabei liefern sie
die Basis für weitergehende Untersuchungen zum besseren Verständnis
der physiologischen und regenerativen Vorgänge, z.B. auch bei
Alterung oder bei gesteigerter Funktion. Darüber hinaus kann
aufgrund der vorliegenden Ergebnisse durch weitere Untersuchungen
möglicherweise besser verstanden werden, ob es gelingen kann das
Potential adulter Stammzellen zur therapeutischen Gewebereparation,
z.B. zur Verhinderung oder Verringerung einer Narbenbildung, zu
nutzen.