Vergleich der Polymerase Kettenreaktion und der Southern Blot Analyse beim Nachweis der BCL-2 Translokation bei Patienten mit centroblastisch-centrocytischen und centroblastischen Non-Hodgkin Lymphomen

In der vorliegenden Arbeit wurde eine vergleichende Untersuchung
der Polymerase Kettenreaktion und der Southern Blot Analyse beim
Nachweis der bcl-2 Translokation bei Patienten mit
centroblastisch-centrocytischen und centroblastischen Non-Hodgkin
Lymphomen durchgeführt. Erstes Ziel der war die Ermittlung der
Häufigkeit der bcl-2 Translokation t(14;18) im Bereich der MBR im
Knochenmark bei einer Gruppe von Patienten mit
centroblastisch-centrocytischen und centroblastischen Non-Hodgkin
Lymphomen im Einzugsgebiet des Tumorzentrums München. Zweites Ziel
war die Untersuchung der Sensitivität und Spezifität der Southern
Blot Analyse und der Polymerase Kettenreaktion im Nachweis der
t(14;18) Translokation als Indikator für Organbefall im Vergleich
mit der histologischen, cytologischen und immuncytologischen
Untersuchung des Knochenmarks oder des peripheren Blutes. Drittes
Ziel war die Untersuchung der Frage, inwieweit die Polymerase
Kettenreaktion bzw. die Southern Blot Analyse zur
Verlaufsbeobachtung bei centroblastisch-centrocytischen und
centroblastischen Non-Hodgkin Lymphomen geeignet ist und ob sich
Patienten mit oder ohne eine nachgewiesene bcl-2 Translokation
bezüglich Allgemeinbefinden nach WHO-Einteilung und des klinischen
Krankheitsstadiums unterscheiden. Die Southern Blot Analyse ist
eine sensitive, jedoch zeit- und kostenintensive Methode zum
Nachweis der bcl-2 Translokation t(14;18). Allein der Schritt der
Autoradiographie der Röntgenfilme kann über 7-14 Tage dauern. Daher
ist die SBA weniger für Routinediagnostik geeignet. Es wird eine
Mindestmenge von 10 µg DNS pro Restriktionsenzym-Verdauprozess, in
der Regel 30 µg DNS benötigt, die nicht bei jeder Patientenprobe
zur Verfügung steht. Störfaktoren können unter anderem ein
unvollständiger Enzymverdau durch Restriktionsenzyme,
Verunreinigung der DNS durch Proteine und Salze, Strangbrüche der
DNS bei zu langem Enzymverdau oder nach erfolgter Chemotherapie
sein. In unserer Untersuchungsgruppe konnte nur bei 17 von 35
Patienten die Southern Blot Analyse genomischer DNS erfolgreich
durchgeführt werden; bei einem von 35 Patienten konnte das Ergebnis
der SBA nicht beurteilt werden. Die SBA kann die bcl-2
Translokation t(14;18) unabhängig von der Bruchpunktregion
nachweisen. Bei 3 von 17 Patientenproben (17.6%) mit negativer PCR
gelang ein Nachweis der Translokation t(14;18) in der SBA. Durch
die SBA wurde in der vorliegenden Arbeit bei fehlendem Hinweis auf
einen Befall durch maligne Zellen im Blut oder Knochenmark durch
die morphologischen Untersuchungsmethoden Histologie, Cytologie und
Immuncytologie eine deutlich niedrigere Detektionsrate an Zellen
mit der Translokation t(14;18) erreicht als mit der PCR (SBA 25.0%
versus PCR 66.7%). Die Polymerase Kettenreaktion kann eine maligne
Zelle unter 106 Zellen detektieren. Die Methode ist schnell und
kostengünstig. In unserem Versuchsansatz lag das Ergebnis im
Durchschnitt innerhalb eines Tages vor. Bei allen der untersuchten
35 Patientenproben konnte die PCR erfolgreich durchgeführt werden.
Zur Steigerung der Sensitivität und Spezifität der Polymerase
Kettenreaktion ist eine Southern Blot Analyse der PCR Amplifikate
zu empfehlen, da in der vorliegenden Arbeit bei 6 von 35 Patienten
(17.1%), bei denen in der Gelelektrophorese der PCR Amplifikate
keine Bande detektierbar war, in der Southern Blot Analyse der PCR
Produkte eine Bande dargestellt werden konnte. Die Ermittlung der
optimalen Versuchsbedingungen für die individuellen Laborgeräte und
Materialien ist unabdingbar. Unter anderem kann die Änderung von
Anlagerungstemperatur, MgCl2-Konzentration, DNS-Menge,
Konzentration der Nukleotide, Art des Verdunstungsschutzfilms,
Konzentration des Agarosegels, Betriebsart des Thermocycler-Gerätes
eine Störquelle bilden und zum Teil hohen Zeit- und Kostenaufwand
bis zur Optimierung der Versuchsbedingungen erfordern. Da in
unserem Patientengut keine cytogenetische Untersuchung durchgeführt
wurde, die eine Translokation t(14;18) nachweist, sondern nur
Untersuchungen auf einen Befall mit malignen Lymphomzellen im Blut
oder Knochenmark (Cytologie, Immuncytologie,
Knochenmarkhistologie), die nicht obligat die Translokation
t(14;18) tragen, fehlte uns ein Referenzwert zur Untersuchung der
Sensitivität und Spezifität der Polymerase Kettenreaktion und der
Southern Blot Analyse. Bei 17 von 35 Patientenproben, bei denen die
SBA nicht durchgeführt werden konnte waren 11 (31.4%) in der PCR
positiv. Bei 3 von 17 (17.6%) Patientenproben, bei denen die SBA
positiv ausfiel war die PCR negativ. Bei 5 von 17 (29.4%)
Patientenproben, bei denen die SBA negativ ausfiel war die PCR
positiv. Sowohl die Southern Blot Analyse als auch die Polymerase
Kettenreaktion haben ihre Grenzen der Sensitivität und Spezifität
im Nachweis der Translokation t(14;18). Bei 29.4% der PCR positiven
Patientenproben entging der SBA der Nachweis, bei 17.6% der SBA
positiven Patientenproben entging der PCR der Nachweis. Beide
Methoden sollten daher zum Nachweis der bcl-2 Translokation
kombiniert angewendet werden. Die Häufigkeit der bcl-2
Translokation in unserer Untersuchungsgruppe mit 35 Patienten im
Einzugsgebiet des Tumorzentrums München ist mit 77.1% für die
kombinierte Anwendung von PCR und SBA vergleichbar mit der
Häufigkeit, die in der Literatur für Patientengruppen in den USA,
in Großbritannien und in den Niederlanden angegeben wird. Die bcl-2
Translokation konnte mit der Southern Blot Analyse bei 58.8%, mit
der Polymerase Kettenreaktion bei 68.6% der Patienten nachgewiesen
werden. Wurden beide Methoden kombiniert, betrug die Nachweisquote
77.1%. Bei 82.9% der Patienten konnte ein peripherer Befall mit
Lymphomzellen durch Kombination der morphologischen
Untersuchungsmethoden Histologie, Cytologie oder Immuncytologie
nachgewiesen werden, dagegen bei 47.1% durch die Histologie allein.
Daher sollten die Histologie, Cytologie und Immuncytologie zum
Nachweis eines peripheren Befalls kombiniert eingesetzt werden. Die
Detektionsrate der Southern Blot Analyse und der Polymerase
Kettenreaktion ist annähernd gleich bei vorliegendem Hinweis auf
einen Befall durch maligne Zellen im Blut oder Knochenmark durch
die morphologischen Untersuchungsmethoden Histologie, Cytologie und
Immuncytologie (SBA 64.3% versus PCR 69.0%). Durch die Southern
Blot Analyse wird bei fehlendem Hinweis auf einen Befall durch
maligne Zellen im Blut oder Knochenmark durch die morphologischen
Untersuchungsmethoden Histologie, Cytologie und Immuncytologie eine
deutlich niedrigere Detektionsrate an Zellen mit der Translokation
t(14;18) erreicht als mit der Polymerase Kettenreaktion (SBA 25.0%
versus PCR 66.7%). Bei fehlendem morphologischem Nachweis eines
peripheren Befalls eignet sich die PCR zum Nachweis der bcl-2
Translokation deutlich besser als die SBA. Unter den Patienten mit
Nachweis eines Knochenmarksbefalls mit Zellen mit der bcl-2
Translokation waren 3 Pat. mit klinischer kompletter Remission, 4
Pat. im klinischen Stadium I A oder I B, 4 Pat. im klinischen
Stadium II A oder II B. Würde die bcl-2 Translokation t(14;18) als
typisch für die malignen Lymphomzellen angesehen, müsste die
Heraufstufung in das Stadium IV erfolgen. Patienten aus unserer
Untersuchungsgruppe mit Nachweis einer bcl-2 Translokation mit der
Southern Blot Analyse bzw. der Polymerase Kettenreaktion zeigten
keinen auffallenden Unterschied im klinischen Verlauf des CB-CC
oder CB Non-Hodgkin Lymphoms im Vergleich zu Patienten ohne
Nachweis einer bcl-2 Translokation. Die Ergebnisse sind jedoch
aufgrund der großen Varianz der klinischen
Verlaufsbeobachtungsdauer und der uneinheitlichen Therapie bei den
untersuchten Patienten nur eingeschränkt auswertbar.