Vergleich von vier verschiedenen PCR-Methoden zum Nachweis von Trypanosoma cruzi im Blut hinsichtlich Sensitivität und Spezifität mit diagnostischer Evaluierung in einem Endemiegebiet

Die Diagnostik der ausschließlich in Lateinamerika vorkommenden
amerikanischen Trypanosomiasis (Chagaskrankheit) bereitet vor allem
in den chronischen Infektionsstadien (Latenz, chronische
Erkrankung) erhebliche Probleme, da in der Regel eine extrem
niedrige Parasitämie vorliegt. Der in der akuten Phase bedeutsame
Parasitennachweis gelingt in den Spätstadien häufig nicht, trotz
Anwendung von Anreicherungsmethoden, Kultur und Xenodiagnose
(Nachweis aus am Patienten angesetzten Überträgerwanzen). Zwar sind
im chronischen Stadium nahezu regelmäßig spezifische Antikörper
nachweisbar, die Aussagekraft der Immundiagnostik ist jedoch
eingeschränkt. So bleibt die Immunantwort oft lebenslang positiv,
auch wenn die Infektion spontan oder nach Chemotherapie ausgeheilt
ist. Zudem gibt es falsch-positive Ergebnisse, z. B. aufgrund von
Kreuzreaktionen mit Leishmanien und anderen Trypanosomen (z. B.
Trypanosoma rangeli). Der sichere Nachweis einer Infektion in den
Spätstadien ist jedoch von erheblicher Bedeutung. So kann durch
eine rechtzeitige Therapie die Manifestation der meist intraktablen
Spätstadien verhindert bzw. reduziert werden. Zudem wäre es
bedeutsam chronische Infektionen bei seropositiven Frauen mit
Kinderwunsch und bei Schwangeren zu erkennen, da auch
asymptomatische Schwangere die Infektion auf das Kind übertragen
können. Schließlich kommt in Hochendemiegebieten ein erheblicher
Teil der Bevölkerung als Blutspender nicht in Frage, da alle
Seropositiven ausgeschlossen werden, auch wenn offen bleibt ob
tatsächlich eine chronische Infektion vorliegt. Zum Nachweis der
extrem niedrigen Parasitämien im chronischen Stadium scheint die
Polymerasekettenreaktion (PCR) besonders vielversprechend.
Mittlerweile sind bereits mehrere PCR-Methoden zum Nachweis von
Trypanosoma cruzi entwickelt und mit sehr unterschiedlichen
Ergebnissen in der Diagnostik und Therapiekontrolle bei zahlenmäßig
noch sehr begrenzten Patientenkollektiven eingesetzt worden. Die
verschiedenen PCR-Protokolle beruhen auf dem Nachweis verschiedener
Genabschnitte der nukleären DNA (nDNA) und der in hoher Kopienzahl
vorliegenden Kinetoplasten-DNA (kDNA). Zudem wurden
unterschiedliche Methoden zur Stabilisierung und Verarbeitung von
Proben publiziert einschließlich solcher unter einfachen
Feldbedingungen, wie sie in den Hauptverbreitungs-gebieten
vorherrschen. Ziel dieser Arbeit war es die wichtigsten dieser
PCR-Methoden unter experimentellen Bedingungen zu vergleichen und
eine Methode zu identifizieren, die eine hohe Sensitivität und eine
hohe Spezifität aufweist und robust funktioniert. Anschließend
sollte eine Validierung mit Proben aus einem Endemiegebiet
erfolgen. Ein weiteres Ziel war dabei, Methoden der
Nukleinsäuren-Isolierung und -Konservierung unter Feldbedingungen
zu untersuchen und zu optimieren. Im ersten Teil der Untersuchungen
wurden 4 verschiedene PCR-Methoden optimiert und unter
experimentellen Bedingungen hinsichtlich Sensitivität, Spezifität
und Robustheit verglichen: (1) eine PCR mit den Primern TCZ1/TCZ2
zur Amplifikation eines konservierten nDNA- Abschnitts von 188
Basenpaaren (bp) einer repetitiven (ca. 700 Kopien/Zelle) Sequenz
mit derzeit noch unklarer Funktion. (2) eine PCR mit den Primern
BP1+BP2 zur Amplifikation eines hochkonservierten nDNA-Abschnitts
von 692 bp des F29-Gens (Flagellin). (3) eine PCR mit den Primern
121/122 zur Amplifikation an zwei konstanten Regionen der kDNA, die
eine variable kDNA-Region umschließen (330 bp). (4) eine nested PCR
mit den Primerpaaren 121+89/90 und 91+122 zur Amplifikation eines
289 bp Abschnitts der kDNA (identische Teilregion der PCR-Methode
Nr. 3) Die höchste Sensitivität für T. cruzi zeigte unter
experimentellen Bedingungen die nested PCR (Methode Nr. 4) mit
einem spezifischen Amplifikationsprodukt bis herab zu einer
Konzentration von 0,001 Parasiten/µl (1 Parasit/ml). Die Spezifität
der PCR-Protokolle TCZ1/2 (repetitive nDNA) und BP1/2
(F29-Flagellin) war hoch. Sie amplifizierten keine Genabschnitte
von anderen Trypanosomatidae, mit Ausnahme eines deutlich
differenten 615-620 bp-Amplifikats für T. rangeli beim
BP1/2-Protokoll. Demgegenüber zeigten sowohl das
121/122-kDNA-Protokoll wie die kDNA-nested PCR nicht von T. cruzi
differenzierbare Amplifikate mit T. rangeli und in der nested PCR
auch mit T. brucei brucei, nicht jedoch bei verschiedenen
Leishmania-Arten. Hinsichtlich ihrer Robustheit erwiesen sich die 4
PCR-Protokolle als unterschiedlich stabil und reproduzierbar. Das
TCZ1/2-Protokoll war nicht stabil und ergab Amplifikate nur in
einem sehr engen Toleranzbereich der Arbeitsbedingungen. Die
anderen drei Methoden erwiesen sich als robust und zeigten im
optimalen Arbeitsbereich stets reproduzierbare Ergebnisse.
Weiterhin wurde 6M Guanidinhydrochlorid (G-HCl) als Zusatz für die
Stabilisierung von Blutproben untersucht. Im Vergleich zu PBS wurde
die Sensitivität der PCR-Protokolle mit G-HCl verbessert. Beim
Vergleich verschiedener Methoden zur DNA-Isolation zeigte der
QIAGEN Blood Mini Kit eine etwas höhere Sensitivität als die
Phenol-Chloroform-Isoamyl-Methode. Im zweiten Teil der
Untersuchungen wurden Blutproben von 44 Patienten mit anamnestisch
diagnostizierter Chagaskrankheit in der Umgebung von Cochabamba,
Bolivien, einem Hochendemiegebiet der Chagaskrankheit abgenommen.
Diese wurden mit 6M Guanidinhydrochlorid stabilisiert und zur
Untersuchung nach München gebracht. Die nested PCR zum Nachweis von
kDNA erwies sich als sensitivste Methode zum Nachweis einer
Parasitämie, bei 6 der 27 seropositiven Proben (22,2%) konnte ein
T.cruzi-spezifisches Amplifikat nachgewiesen werden. Das
121/122-kDNA-Protokoll amplifizierte bei 4 der 27 Proben eine
T.cruzi-spezifische Sequenz (14,8%). Mit Ausnahme eines Falles
waren alle PCR-positiven Patienten bisher nicht therapiert worden.
Mit den beiden nDNA-Protokollen (TCZ1/2- und BP1/2- Protokoll)
ergab sich bei keiner dieser Proben ein Amplifikat. Bei den
serologisch negativen oder grenzwertigen Patientenproben konnten
mit keinem der 4 PCR-Protokolle ein Amplifikat nachgewiesen werden.
Zudem wurden noch 30 Blutproben von gesunden Erwachsenen aus
Deutschland untersucht. Hierbei zeigten sich ebenfalls keine
Amplifikate bei den 4 Protokollen. Zusammengefaßt ergaben die
Untersuchungen, daß die PCR-Protokolle zum Nachweis von kDNA am
sensitivsten Trypanosoma cruzi im Blut nachweisen können; mit
besonders hoher Sensitivität der nested PCR-Methode. Dies beruht
wohl auf der hohen Kopienzahl der amplifizierten Zielsequenz in den
kDNA-Minicircles (ca. 10.000 Kopien/Zelle) im Vergleich zu den
untersuchten nDNA-Zielsequenzen. Allerdings werden von den
kDNA-Protokollen auch andere Trypanosomen wie T. rangeli und T.
brucei brucei (nur bei der nested PCR) miterfasst, im Gegensatz zu
den hochkonservierten Zielsequenzen der untersuchten
nDNA-Protokolle.