Einfluss freier Sauerstoffradikale auf das Zellvolumen von Gliazellen

Das zytotoxische Hirnödem ist eine wichtige Manifestation des
zerebralen Sekundärschadens nach zerebraler Ischämie und
Schädel-Hirn-Trauma. Der Analyse von Schwellungs- und
Schädigungsmechanismen auf zellulärer Ebene in vivo ist durch die
Komplexität der zeitgleich ablaufenden Ereignisse enge Grenzen
gesetzt. Für die vorliegenden Experimente wurde deswegen ein in
vitro Modell verwendet, welches die Untersuchung von C6-Gliomzellen
als Einzelzellsuspension unter definierten und kontrollierten
Bedingungen bei Veränderung verschiedener Parameter erlaubt. In den
letzten Jahren konnten am Institut für Chirurgische Forschung
anhand dieses Modells einige Mediatoren des zytotoxischen Ödems in
vitro identifiziert werden. Die vorliegende Arbeit ist eine
Fortsetzung der durchgeführten Untersuchungen zur Aufklärung der
Mechanismen der zytotoxischen Zellschwellung. Sie befasst sich mit
der Frage, welchen Einfluß freie Sauerstoffradikale (ROS) auf das
Zellvolumen und die Zellvitalität von C6-Gliazellen in vitro haben.
Freie Sauerstoffradikale werden unter akuten pathologischen
Bedingungen vermehrt im Gehirn freigesetzt. Sie erzeugen durch ihre
starke Reaktionsfähigkeit vielfältige pathophysiologische Wirkungen
im Gehirn, die zur Zerstörung von Zellmembranen, Oxidation
zellulärer Strukturen und DNS-Strangbrüchen führen. Für die Analyse
des im Mittelpunkt stehenden Parameters Zellvolumen wurde die
Durchflußzytometrie eingesetzt. Die Vitalität der Zellen wurde
anhand der Trypanblau-Ausschlußmethode ermittelt. Im ersten
Abschnitt dieser Arbeit wurde der Einfluß von Wasserstoffperoxid
(H2O2) auf das Volumen und die Vitalität von C6-Gliomzellen
untersucht. Die Zellvolumenänderung von C6-Gliomzellen durch H2O2
unterliegt einer Dosis-Wirkungsbeziehung. 0,1 mM H2O2 bewirkte über
den Beobachtungszeitraum von 120 Minuten keine Volumenänderung. Ab
einer Endkonzentration von 0,5 mM H2O2 kam es zu einer raschen
Zellvolumenabnahme. Es folgten biphasische Verläufe der
Volumenänderungen unter 0,5, 1,0 und 5,0 mM H2O2. Das Zellvolumen
erreichte nachfolgend das Ausgangzellvolumen. Unter der Applikation
von 5,0 mM H2O2 kam es in der zweiten Stunde des
Beobachtungszeitraumes zu einer signifikanten Zellschwellung. 84 In
weiteren Versuchen induzierten wir oxidativen Stress extrazellulär
durch das Enzym Xanthinoxidase mit dem Substrat Hypoxanthin
(HX/XOD) in den Enkonzentrationen 1 mM HX, 10 oder 20 mU/ml. HX/XOD
provozierte in beiden Versuchsreihen eine prompte Abnahme des
Zellvolumens auf Werte um 90% des Ausgangszellvolumens. Das
Zellvolumen zeigte während des Beobachtungszeitraumes keine
Rückregulation, wie in den Versuchen mit H2O2. XOD 10 mU/ml ohne HX
zeigte einen ähnlichen Verlauf der Volumenänderung. Die Applikation
von HX alleine bewirkte keine Volumenänderung. Mit dem Pharmakon
Menadion (MQ), das Zellmembranen passieren kann, induzierten wir
oxidativen Stress intrazellulär. Menadion wurde in den
Enkonzentrationen 25 und 50 µM verwendet. Während nach Applikation
von 25 µM Menadion keine Volumenänderung bei C6-Gliomzellen zu
verzeichnen war, provozierte 50 µM Menadion eine signifikante
Zellschrumpfung nach einer Latenzphase von 100 Minuten. Eine
extrazelluläre Laktatazidose von 6,8 führte, wie bereits bekannt,
zu einer Schwellung von C6-Gliomzellen auf 115% des Ausgangswertes.
Die Zellvitalität blieb unverändert. In Kombination mit oxidativem
Stress mittels HX/XOD 1/10 mM/mU/ml, zeigte sich eine dazu
spiegelbildlich verlaufende Zellschrumpfung. Offensichtlich hemmen
freie Radikale demnach die Mechanismen die zur azidoseinduzierten
Zellschwellung führen, wie z.B. den Na+/H+-Antiporter. Diese
Annahme haben wir mit dem Na+/H+-Inhibitor Amilorid bestätigt. Die
radikalinduzierte Zellvolumenänderung konnte mit Amilorid fast
vollständig gehemmt werden. Die Vitalität der C6-Gliomzellen zeigte
in keiner der Versuchreihen eine Abnahme über den gesamten
Beobachtungszeitraum. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen,
dass freie Sauerstoffradikale in vitro zu einer Schrumpfung von
C6-Gliomzellen führen. Die Ergebnisse legen somit den Schluß nahe,
dass freie Sauerstoffradikale nicht an der Pathogenese des
zytotoxischen Hirnödems beteiligt sind. Freie Sauerstoffradikale
sind allerdings in der Lage, die Clearence-Funktion von Gliazellen
zu stören. So konnten ROS die Aufnahme von H+-Ionen (zusammen mit
der konsekutiven Aufnahme von Na+-Ionen) und die daraus folgende
kompensatorische Zellschwellung hemmen. Freie Radikale scheinen
also nicht direkt toxisch zu wirken, sondern über die Hemmung
Astrozyten-vermittelter neuroprotektiver Mechanismen, wie z.B. die
Clearence von H+ aus dem Extrazellulärraum. Weitere Untersuchungen
müssen diesen Anfangsverdacht im Detail klären.