Untersuchungen zur Kryokonservierung hämatopoetischer Stammzellen aus menschlichem Knochenmark mit Trehalose

Knochenmark oder periphere Blutstammzellen (PBSC) werden unter
anderem für autologe oder, z.B. aus logistischen Gründen, für
allogene hämatopoetische Stammzelltransplantationen
kryokonserviert. Üblicherweise wird hierfür das Knochenmark 1:1 mit
einer 20%igen DMSO – Lösung gemischt und kontrolliert eingefroren.
Das frisch aufgetaute Knochenmark–DMSO Gemisch wird dem Patienten
bei etwa 4°C infundiert, um eine bei höheren Temperaturen verstärkt
stattfindende Zellschädigung durch DMSO zu vermeiden. Diese
Transplantationsmethode mit DMSO-kryokonservierten Zellen birgt für
den Patienten ein nicht unerhebliches Risiko belastender und selten
auch lebensbedrohlicher Reaktionen. Diese können einerseits durch
die niedrige Reinfusionstemperatur des Transplantats, andererseits
aber auch durch den Gehalt an DMSO im Transplantat hervorgerufen
werden. Deshalb wurde in dieser Arbeit das Disaccharid Trehalose im
Hinblick auf seine Eignung als mögliche Alternativsubstanz zu DMSO
geprüft. Um das Überleben von hämatopoetischen Stammzellen
untersuchen zu können, mußten zunächst die optimalen Bedingungen
für die Langzeitkultur von frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen
aus mit DMSO- oder Trehalose-kryokonserviertem Knochenmark
untersucht werden. Bei diesen Versuchen zeigte sich, dass sich als
Überlebensmatrix in der Langzeitkultur (Feeder-Layer) am besten
frisch entnommene und bestrahlte Zellen aus Knochenmarkblut
eigneten. Unter Verwendung dieses Feeder-Layers konnte nachgewiesen
werden, dass nach einer 5-wöchigen Kultur sowohl DMSO- als auch
Trehalose-kryokonservierte Zellen in der Lage waren, im
Methylzellulose-Assay Kolonien zu generieren. Sowohl im Hinblick
auf die Anzahl, als auch auf den Grad der Differenzierung der im
Methylcellulose-Assay gezüchteten Zellen fand sich kein
signifikanter Unterschied zwischen Zellen, die primär mit DMSO oder
mit Trehalose als Frostschutzsubstanz eingefroren wurden. Nachdem
bekannt ist, daß DMSO in vitro eine Komplementaktivierung
verursacht und es darüberhinaus Hinweise gibt, daß die Höhe der
Komplementaktivierung mit der Häufigkeit und Schwere der bei der
Transplantation auftretenden Nebenwirkungen korreliert,
untersuchten wir zusätzlich im Radioimmunoassay die Höhe der C3a –
Konzentration in mit DMSO- oder Trehalose-tiefgefrorenem
Knochenmarkblut. Dieser Assay lieferte jedoch, insbesondere bei mit
Trehalose-kryokonservierten Zellen nur schwer reproduzierbare
(große Standardabweichung) Ergebnisse, die möglicherweise durch die
hohe Viskosität der Trehaloselösung bedingt waren. Deshalb kann mit
den hier vorgelegten Ergebnissen keine sichere Aussage bezüglich
des Komplement-aktivierenden Potentials von Trehalose getroffen
werden. Trotzdem belegen die hier beschriebenen Versuche, daß
Trehalose eine vielversprechende Substanz für den Schutz von
hämatopoetischen Stammzellen bei der Kryokonservierung ist. Vor dem
klinischen Einsatz beim Menschen, sollten jedoch noch Versuche im
Tiermodell erfolgen, um die Sicherheit und Effektivität dieses
Verfahrens auf eine noch solidere Basis zu stellen.