Das Phagenschock-Protein LiaH aus Bacillus subtilis

Für das Überleben von Bacillus subtilis ist eine verlässliche
Überwachung der Integrität der Zellhülle essentiell, um diese zu
schützen und bei Schäden adäquat zu reagieren. Neben den ECF �
Faktoren spielen Zwei-Komponenten-Systeme (2KS) in der
Zellhüllstressantwort von B. subtilis eine zentrale Rolle. Eines
dieser Systeme, das LiaRS- 2KS reagiert auf eine große Anzahl
verschiedener Zellwand-Antibiotika sowie andere
zellhüllstress-auslösende Substanzen. Die zelluläre Funktion und
Rolle des Lia-Systems konnte bisher nicht genau definiert werden.
In der hier vorliegenden Dissertation wurde das Lia-System erstmals
hinsichtlich seiner funktionalen Rolle in B. subtilis untersucht.
Im ersten Teil der Ergebnisse wurde eine detaillierte Analyse der
LiaR-vermittelten Zellhüllstressantwort in B. subtilisvorgenommen.
Transkriptom-Studien dienten zur Identifizierung des LiaR-Regulons.
Hierbei wurde die Genexpression des Wildtyps mit zwei Mutanten, die
den „ON“ (�liaF) und „OFF“ (�liaR) Zustand des Lia-Systems
repräsentierten, verglichen. Von den dabei identifizierten drei
potentiellen LiaR-Zielloci (liaIH, yhcYZ-ydhA, ydhE) konnten durch
anschließende Folgeuntersuchungen nur die Gene liaI und liaH als in
vivo relevante Zielgene für LiaR verifiziert werden. Umfangreiche
phänotypische Analysen zeigten, dass �liaIH-Mutanten nur schwach
sensitiv auf einige Antibiotika sowie oxidativen Stress reagierten.
Ebenso vermittelt eine Überexpression von LiaH in einer
�liaF-Mutante keine Resistenz gegenüber stressauslösenden
Substanzen. LiaH gehört zur Familie der Phagenschock-Proteine.
Weitere Mitglieder dieser Familie sind PspA aus Escherichia coli
und Vipp1 aus Arabidopsis thaliana, die große oligomere
Ringstrukturen bilden. Die strukturelle Untersuchung von LiaH
ergab, dass auch dieses Protein große Ringe bildet (>1MDa). Der
zweite Ergebnisteil befasst sich mit der Untersuchung der
Stimuluswahrnehmung der Zellhüllstress-detektierenden Systeme in B.
subtilis. Die Zellhüllstressantwort auf das Antibiotikum Bacitracin
wurde hierbei mittels �-Galaktosidase-Assay sowie Western Blot-
Analyse erforscht. Das Bce-System reagiert dabei am stärksten und
spezifischsten auf Bacitracin-Stress. Es wurde ebenfalls
festgestellt, dass der ABC-Transporter BceAB essentiell für die
Stimuluswahrnehmung ist und dass das Bce-System an sich eine
Resistenzdeterminante in B. subtilis darstellt. Das Lia-System
hingegen wird erst bei höheren Bacitracin-Konzentrationen
induziert. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass
das Bce-System Bacitracin direkt wahrnimmt (drug sensing) und das
LiaSystem in indirekter Weise auf Zellhüllstress ausgelöst durch
Bacitracin reagiert (damage sensing). Im dritten Teil der
Ergebnisse wurdendie zelluläre Lokalisation von LiaI, LiaH und LiaG
sowie die Beziehung der Proteine untereinander mittels
Fluoreszenz-Mikroskopie und biochemische Ansätze untersucht. Die
Membranproteine LiaI und LiaG sind unter Stressbedingungen in der
Zellmembran lokalisiert. LiaH, ein cytoplasmatisches Protein
verändert unter Stressbedingungen seine Lokalisation vom Cytoplasma
an die Membran. Die Funktion von LiaH scheint sich also an der
Zellmembran zu vollziehen, wobei LiaI als Interaktionspartner
identifiziert wurde. Da in einer �liaI-Mutante LiaH unter
Stressbedingungenebenfallsnoch an die Zellmembran assoziert ist,
wurde nach weiteren Interaktionspartnern von LiaH gesucht. Eine
umfangreiche bacterial-two-hybrid-Analyse ergab, dass sowohl LiaH
als auch LiaI und LiaG in ein Interaktionsnetzwerk eingebettet
sind, in welchem das bisher uncharakterisierte Protein YvlB eine
Schlüsselrolle spielt.Die ebenso in dieses Netzwerk involvierten
Proteine YjoB, DnaK und HtpG üben als Proteasen/Chaperone
Funktionen in der Faltung und Degradierung von Proteinen aus. Ein
Zusammenspiel des Lia-Systems und des Schlüsselproteins YvlB mit
den Proteasen/Chaperonen als Reaktion auf Zellhüllstress ist
denkbar. Die Phagenschock-Homologe PspA in Streptomyces lividans
und E. coli üben einen erheblichen Einfluss auf die
Proteinsekretion sowie die elektronenmotorische Kraft der Zelle
aus. Daher wurde im letzten Teil der Ergebnisse die Rolle von LiaH
in der Proteinsekretion sowie im Energiestoffwechsel näher
analysiert. Ein Einfluß des Lia- Systems in der Aufrechterhaltung
der elektronenmotorischen Kraft der Zelle konnte nicht bestätigt
werden. Durch die Analyse des Sekretoms in B. subtilis konnte
gezeigt werden, dass das extrazelluläre Proteom einer
�PliaI-liaIH-Mutante im Vergleich zum Wildtyp signifikante
Veränderungen in der Komposition aufwies.So wurde im Sekretom der
�PliaIliaIH- Mutante vor allem das Zellwand-assoziierte Protein
WapAidentifiziert, welches im Wildtyp oder in einer �liaF-Mutante
nicht auftrat. Das Lia-System beeinflußt somit auch die
Proteinsekretion von B. subtilis, wobei die molekularen Mechanismen
noch unbekannt sind.