Etablierung der Interaktion des viralen Onkoproteins LMP1 mit den zellulären Signalproteinen der TRAF-Proteinfamilie als Zielstruktur für Inhibitoren

Das Epstein-Barr Virus (EBV) ist mit einer Reihe von
lebensbedrohlichen Krankheiten assoziiert. Dazu zählen unter
anderem Nasopharynxkarzinome, Hodgkin-Lymphome und
lymphoproliferative Erkrankungen nach Organtransplantationen.
Dennoch gibt es bisher keinen wirksamen Therapieansatz, der sich
spezifisch mit der Rolle von EBV in diesen malignen Erkrankungen
auseinandersetzt. Das latente Membranprotein 1 (LMP1) ist das
primäre Onkogen von EBV und essenziell für die Transformation von
B-Zellen durch das Virus. Für eine effiziente Transformation von
Zellen ist die Aktivierung verschiedener zellulärer Signalwege
durch LMP1 notwendig. LMP1 besitzt jedoch keine enzymatische
Aktivität und die Induktion der Signalwege ist somit abhängig von
der Rekrutierung verschiedener zellulärer Adapterproteine. Die
Ausbildung der notwendigen Signalkomplexe wird über zwei
C-terminale Aktivierungs-Regionen (CTAR1 und CTAR2) vermittelt.
Verschiedene Mitglieder der Tumornekrosefaktor
(TNF)-Rezeptor-assoziierten Faktoren (TRAF)-Protein-Familie spielen
bei der Induktion der Signalwege durch diese beiden CTAR-Domänen
eine zentrale Rolle. Nach grundlegenden
Protein-Protein-Interaktionsstudien zwischen LMP1 und rekombinanten
TRAF-Proteinen wurde hier die Interaktion zwischen TRAF2 und LMP1
als Zielstruktur für Inhibitoren vorgestellt. TRAF2 ist essenziell
für die Aktivierung des NF-κB-Signalweges durch die CTAR1-Domäne
und somit für das Überleben EBV-transformierter Zellen. Die Bindung
von TRAF2 an LMP1 wurde biochemisch näher charakterisiert und die
gewonnen Erkenntnisse verwendet, um ein System zu etablieren, mit
dem Inhibitoren gegen den Komplex aus LMP1 und TRAF2 identifiziert
werden können. Dieses ELISA-basierte System erfüllt die
Anforderungen, die allgemein an hochdurchsatzfähige Systeme
gestellt werden. In einem Pilotscreen einer Bibliothek mit
Naturstoffen wurden Substanzen identifiziert, die die Bindung von
TRAF2 an LMP1 in vitro inhibierten. Die potenteste Substanz
inhibierte die Interaktion von TRAF2 und LMP1 mit einem IC50 von 8
µM in diesen in vitro Studien. Weiterhin zeigte diese Substanz eine
spezifische biologische Wirkung auf die Vitalität von
EBV-transformierten B-Zellen. Zusätzlich konnte in den
Protein-Protein-Interaktionsstudien zwischen den verschiedenen
TRAF-Proteinen und LMP1 erstmals eine direkte Bindung von TRAF6 an
LMP1 gezeigt werden. Entgegen der bisherigen Modellvorstellung,
nach der TRAF6 indirekt über Adapterproteine an LMP1 gebunden wird,
konnte hier gezeigt werden, dass TRAF6 direkt an die LMP1-Sequenz
P379VQLSY innerhalb der CTAR2-Domäne bindet. Diese Sequenz ist
essenziell für die Aktivierung verschiedener TRAF6-abhängiger
Signalwege durch die CTAR2-Domäne. Auf der Oberfläche von TRAF6
wird die Bindung an LMP1 durch dieselbe Bindetasche vermittelt,
über die auch die Interaktion mit zellulären Rezeptoren
stattfindet. Diese direkte Interaktion zwischen LMP1 und TRAF6 ist
wichtig für die Aktivierung des NF κB-Signalweges durch die
CTAR2-Domäne. TRAF6-Mutanten, die nicht mehr in der Lage waren, mit
LMP1 zu interagieren, waren ebenfalls nicht mehr dazu fähig, die
Induktion von NF κB-Signalen durch die CTAR2-Domäne von LMP1 in
embryonalen TRAF6-/- Mausfibroblasten wiederherzustellen. Ebenfalls
konnte neben der direkten Bindung von TRAF6 an LMP1 hier eine
weitere neue Protein-Protein-Interaktion für TRAF6 beschrieben
werden. TRAF6 bindet direkt an das TNF-Rezeptor-assoziierte
Todesdomänenprotein (TRADD). Die Interaktion zwischen TRAF6 und
TRADD unterscheidet sich jedoch von der Bindung anderer
TRAF-Proteine an TRADD. Die in vitro Studien zeigten, dass TRAF6 in
der Lage ist, sowohl mit Teilen des N-Terminus, als auch mit Teilen
des C-Terminus von TRADD zu interagieren. Diese bisher nicht
beschriebene Art der direkten Interaktion von TRAF6 mit TRADD
eröffnet neue Einblicke in den Aufbau des LMP1-Signalkomplexes.