Proliferation and arrest of human tetraploid cells

Durch Fehler entstandene tetraploide Zellen sind chromosomal
instabil und können zu Zelltransformation führen. Die Beweise
verdichten sich, dass die Propagation von tetraploiden
Säugetierzellen durch einen p53-vermittelten Arrest eingeschränkt
wird; jedoch ist weiterhin unklar, was die Ursache dieses
p53-vermittelten Arrests ist. Um die Ursache des p53-vermittelten
Arrests zu identifizieren, wurden individuelle Zellen mittels
zeitraffender Mikroskopie in Echtzeit verfolgt. Neu entstandene
tetraploide Zellen können einen Zellzyklus vollenden, aber die
Mehrzahl der Zellen starb oder verharrte in einem Arrest in der
folgenden G1-Phase, abhängig davon ob die vorangegangene Mitose
fehlerfrei verlief oder nicht. Tochterzellen, denen eine
fehlerhafte Mitose voranging, akkumulierten p53 im Zellkern, was
zum Zelltod oder einem irreversiblen Zellzyklusarrest führte. Es
zeigte sich durch den Anstieg von 8-OHdG, einem Indikator für
oxidative DNA Schädigung, dass tetraploide Zellen durch die
vermehrten fehlerhaften Mitosen höheren Konzentrationen von
reaktiven oxidativen Spezien (ROS) ausgesetzt sind. Der Anstieg von
8-OHdG korrelierte mit der p53-Akkumulation im Zellkern. Da keine
vermehrte Phosphorylierung des Histons H2AX (γ-H2AX), ein Marker
für DNA-Strangbrüche, detektiert wurde, lässt sich schlussfolgern,
dass ROS entscheidend für den p53 vermittelten Arrest
verantwortlich sind. Mehrere p53-aktivierende Kinasen wurden
mittels RNA Interferenz (RNAi) und chemischer Genetik untersucht,
ob sie einen Einfluss auf den Zellzyklusarrest von tetraploiden
Zellen haben. Von den getesteten Kinasen hatte nur ATM einen
Einfluss auf die Aktivierung von p53 nach fehlerhaften tetraploiden
Mitosen. Zwar wird ATM in der Regel durch DNA-Schäden aktiviert,
jedoch wurde bereits zuvor gezeigt, dass ATM auch durch erhöhte ROS
Konzentrationen aktiviert werden kann. Um die Zusammenhänge des
Zellzyklusarrests weiter aufzuklären, wurde ein genomübergreifender
esiRNA Screen etabliert, der die Zellproliferation nach induzierter
Tetraploidisierung analysiert. Durch Kombination der
Zellzyklusanalyse an Hand des DNA-Gehalts zusammen mit den
FUCCI-Zellzyklusindikatoren, konnten tetraploide und diploide
Zellen nebeneinander mikroskopisch analysiert werden, ohne zuvor
tetraploide und diploide Zellen isolieren zu müssen. Dieser neue
experimentelle Ansatz ermöglichte die Identifikation von Genen, die
spezifisch die Proliferation von tetraploiden Zellen verstärken
oder einschränken Im Primärscreen wurden 1159 Gene identifiziert,
deren Inhibition die Proliferation einschränken. Weiter wurden 431
Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation der
tetraploiden Zellen verstärken. Von den 431 Genen, deren Inhibition
die Proliferation verstärken, wurden 371 Gene einem
Konfirmationsscreen unterzogen, in dem 158 der identifizierten 371
Gene bestätigt wurden. Die bioinformatische Analyse der 158 Gene
zeigte eine signifikante Anhäufung von Genen, die mit
DNA-Replikation, dem kanonischen Wnt-Signalweg oder mit
Tumorsignalwegen assoziiert sind. Unter letzteren ist CCDC6 sehr
interessant, da dessen Genprodukt durch ATM phosphoryliert wird und
nachgeschaltet den Tumorsuppressor 14-3-3σ reguliert. Des weiteren
wurden mittels einer Meta Analyse der Ergebnisse des Primärscreens,
zusammen mit den Daten aus dem “Project Achilles”, welches
genomweit den Effekt von shRNA-vermittelter Geninhibition auf die
Proliferation von 108 Krebszelllinien untersuchte, 18 Gene
identifiziert, deren Inhibition sowohl die Proliferation von
tetraploiden Zellen einschränkt, als auch die Proliferation von
Zelllinien hemmt, welche von Krebsarten stammen, die zu meist
chromosomale Instabilitäten (CIN) aufweisen. Damit bilden die
präsentierten Daten nicht nur eine gute Basis zur Aufklärung des
Zellzyklusarrests tetraploider Zellen, sondern auch für die
Identifikation neuer potentieller Zielmoleküle, welche benutzt
werden können um Tumorerkrankungen mit chromosomaler Instabilität
zu behandeln, welche häufig resistent gegen die bislang verfügbaren
Behandlungen sind.