Strukturelle und funktionale Analyse der Effektordomäne des pH-abhängigen Einkomponentensystems CadC in Escherichia coli

Das Einkomponentensystem CadC in Escherichia coli zählt zur Gruppe
der ToxR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren und aktiviert bei
niedrigem pH-Wert die Expression des cadBA-Operons, einem
Säure-induzierbaren Lysin-Decarboxylase-System.
Transkriptionsregulatoren der ToxR-Familie zeichnen sich durch
einen gemeinsamen modularen Aufbau aus und bestehen aus einer
periplasmatischen Sensordomäne, einer Transmembranhelix und einer
zytoplasmatischen Effektordomäne. Die Signalwahrnehmung,
-weiterleitung und -verarbeitung erfolgt bei den ToxR-ähnlichen
Transkriptionsregulatoren innerhalb eines einzelnen Proteins. Die
molekularen Mechanismen der Reizwahrnehmung durch CadC sind
bekannt, die Signalweiterleitung und -verarbeitung im Zytoplasma
sind hingegen weitgehend ungeklärt. In CadC ist ein
zytoplasmatischer Linker (51 Aminosäuren) essentiell für die
Signaltransduktion von der sensorischen Domäne zur DNA-Bindedomäne.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Mechanismus der
Signalweiterleitung von der sensorischen Domäne zur DNA-Bindedomäne
untersucht. Mit Hilfe der Kernspinresonanzspektroskopie konnte
gezeigt werden, dass die Linkerregion unstrukturiert vorliegt. Im
Rahmen einer umfangreichen Mutagenesestudie wurde beobachtet, dass
sowohl eine Vielzahl an Aminosäuresubstitutionen (Veränderungen der
Ladung, der Rigidität oder der Wahrscheinlichkeit zur Bildung einer
α-Helix) als auch die Verlängerung des CadC-Linkers zu keiner
funktionellen Beeinträchtigung führte. Jedoch wurde die
Signalverarbeitung im Zytoplasma durch Verkürzung des Linkers
modifiziert und verursachte ein invertiertes Expressionsprofil des
Zieloperons cadBA oder die Entkopplung der Expression vom externen
pH. Der Linkerregion in CadC konnte keine Rolle in der
Oligomerisierung zugeordnet werden. Unabhängig vom Linker wurde in
einer in vivo Interaktionsstudie eine pH-abhängige Interaktion (pH
< 6,8) zwischen CadC-Monomeren gezeigt. Im zweiten Teil dieser
Arbeit wurde die Röntgenkristallstruktur (2,0 Ångström) und in
einem parallelen Ansatz die NMR-Struktur (0,46 backbone RMSD) der
zytoplasmatischen Effektordomäne in CadC als erste dreidimensionale
Struktur der DNA-Bindedomäne eines ToxR-ähnlichen Regulators
aufgeklärt. In der Struktur von CadC1-107 wurde ein „winged
Helix-Turn-Helix“-Motiv aus der Familie der OmpR-ähnlichen
Transkriptionsregulatoren beobachtet. Im Gegensatz zu der Topologie
bereits gelöster OmpR-ähnlichen Regulatoren enthält CadC am
Übergang von DNA-Bindedomäne und Linkerregion einen zusätzlichen
β-Strang (β-Strang 7), welcher sich stabilisierend auf die
DNA-Bindung auswirken könnte. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde
der DNA-Bindemechanismus von CadC an den cadBA-Promotor untersucht.
In in vitro Versuchen zur Bindung von löslichen CadC-Varianten an
DNA konnte eine sehr geringe Dissoziationsrate beobachtet werden.
Somit ist nicht die Affinität zur DNA sondern die
Stimulus-abhängige Interaktion von CadC mit der α-Untereinheit der
RNA-Polymerase essentiell für die Aktivierung des cadBA-Operons.
Außerdem wurden, basierend auf der Kristallstruktur der
DNA-Bindedomäne von CadC Aminosäuresubstitutionen durchgeführt. Die
Aminosäure His66 in der Erkennungshelix α3 ist an der Interaktion
mit der großen Furche der DNA beteiligt, während die Aminosäuren
Lys95 und Arg96 die Interaktion mit der kleinen Furche der DNA
vermitteln. Die Ergebnisse dieser Arbeit postulieren ein Modell zur
Signalverarbeitung in CadC, in welchem die Signalwahrnehmung im
Periplasma zu konformationellen Veränderungen des unstrukturierten
CadC-Linkers führt und somit die räumliche Positionierung der
DNA-Bindedomänen im CadC-Dimer ermöglicht wird.