Untersuchung der gesteigerten Zytotoxizität von Trabectedin durch Hyperthermie in Tumorzellen

Adulte Weichgewebesarkome (engl. soft tissue sarcoma; STS) werden
zu einer Gruppe seltener maligner und teilweise aggressiver Tumoren
klassifiziert, die eine Tendenz zur Bildung von hämatogenen
Fernmetastasen aufweisen. Die Kombination der Regionalen
Hyperthermie mit einer Chemotherapie erwies sich in vorangegangenen
Studien als eine vielversprechende Behandlungsoption beim
lokalisierten Hochrisiko STS. Es wurde gezeigt, dass eine
neoadjuvante Chemotherapie mit Regionaler Hyperthermie bei diesen
Sarkomen das Tumoransprechen, das lokale progressionsfreie und das
krankheitsfreie Überleben im Vergleich zu einer alleinigen
Chemotherapie signifikant verbessert. Auf zellulärer Ebene
induziert ein Hitzeschock (HS) bei klinisch relevanten Temperaturen
(41,8°C/43°C) unter anderem eine temporäre Defizienz der Homologen
Rekombinationsreparatur (HR), einem essentiellen Mechanismus für
die fehlerfreie Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB). Dies
steht im Zusammenhang mit einer hitzeinduzierten proteosomalen
Degradierung von BRCA2, einer unerlässlichen Komponente der HR.
Trabectedin (Tr) ist eine antiproliferativ wirksame Substanz, die
ursprünglich aus dem marinen Tunikat Ecteinascidia turbinata
isoliert wurde. Die vielfältigen zytotoxischen Aktivitäten von Tr
umfassen neben dem Interferieren mit der aktivierten Transkription
und der Modulation der Tumor-Mikroumgebung hauptsächlich die
Induktion von DSBs. Seit 2007 wird Tr in der Zweitlinientherapie
zur Behandlung refraktärer STS, sowie bei Patienten eingesetzt, bei
denen die Erstlinientherapie (Ifosfamid und/oder Doxorubicin) nicht
angewendet werden kann. In Anbetracht der hitzeinduzierten
Inaktivierung von BRCA2 und den DNA schädigenden Eigenschaften von
Tr wurde in dieser Arbeit untersucht, ob und wie die Hyperthermie
zu einer Wirkungsverstärkung der zytotoxischen Effekte von Tr
beitragen kann. Tr bewirkt in vitro bei Zelllinien
unterschiedlicher Sarkomentitäten (U2Os, SW872, SW982) eine
dosisabhängige Reduktion des klonogenen Überlebens, das durch einen
HS zusätzlich verstärkt wird. Die erhöhte antiproliferative
Aktivität von Tr nach einem HS wird als thermale Chemosenitivierung
definiert. Zudem konnte durch die Analyse der DNA-Verteilung bei
U2Os und SW872 Zellen eine Intensivierung und Verlängerung der
Tr-induzierten G2/M-Blockade nachgewiesen werden. Darüber hinaus
wurden Zelllinien-spezifische Unterschiede bezüglich einer
behandlungsinduzierten Apoptoseinduktion oder Senseszenzantwort
identifiziert. SW872 Zellen weisen einen dosis- und
temperaturabhängigen Anstieg des Anteiles apoptotischer Zellen auf,
der mit einer starken Aktivierung der Effektorcaspasen 3 und 7
einhergeht. Dem entgegen gehen U2Os Zellen in eine ausgeprägte
behandlungsinduzierte zelluläre Seneszenz über. Anhand der
quantitativen Analyse Tr-induzierter H2AX Foci hat sich ein
relevanter Anstieg an DSBs durch eine zusätzliche Hitzeexposition
herausgestellt, der eine Beeinträchtigung der BRCA2-vermittelten
vollständigen Assemblierung der DNA-Reparaturfoci vermuten lässt.
Die Hypothese einer thermalen Chemosensitivierung gegenüber Tr
durch eine hitzeinduzierte HR-Defizienz – insbesondere im Rahmen
der hitzeinduzierten BRCA2 Degradierung – wurde zudem durch das
Ausbleiben der hitzebedingten Verstärkung der Tr-induzierten
Zytotoxizität bei BRCA2-defizienten Zellen bekräftigt. Darüber
hinaus wurde durch Hochdurchsatzanalysen bestätigt, dass eine
hitzevermittelte, erhöhte antiproliferative Aktivität von Tr nach
einem Knockdown zahlreicher HR-spezifischer Komponenten ausbleibt.
Durch Hochdurchsatzanalysen sowie durch anschließende
Validierungsexperimente wurden Proteine identifiziert, die sich als
relevant für weitere präklinische und klinische Untersuchungen
herausgestellt haben. Die Proteine BRCA1, PARP1 und CHEK1 stellen
dabei potentielle molekulare Marker für ein Tumoransprechen auf die
Kombinationstherapie von Tr und Hyperthermie dar. Deren Inhibition
erwies sich zudem als eine weitere Strategie, um die Effektivität
der ursprünglichen Behandlung zusätzlich zu erhöhen. Darüber hinaus
wurde die Funktion von FANCD2 als prädiktiver Marker und von ERCC1
als Resistenzmarker für das Therapieansprechen einer alleinigen
Tr-Behandlung in vitro bestätigt. Die herausgearbeitete thermale
Chemosensitivierung gegenüber Tr mit Hyperthermie durch die
induzierte HR-Defizienz mittels passagerer BRCA2 Degradierung
(induzierte synthetische Letalität) sowie die Identifizierung
weiterer Proteine, deren medikamentöse Inhibition die Effektivität
der Kombinationsbehandlung zusätzlich erhöhen könnte, eröffnen neue
Möglichkeiten in der Therapie solider Tumoren.