Die genomische Organisation und transkriptionelle Regulation des Transkriptionskorepressors Nab2

Nab2 ist in Melanomen und Melanomzelllinien im Vergleich zu
Melanozyten und benignen Nävi stark überexprimiert. Durch
Stimulation mit Wachstumsfaktoren oder Phorbolester kann Nab2
außerdem in allen Geweben und Zelllinien transient induziert
werden. Die Expressionskinetik folgt dabei der eines delayed early
response-Gens. Das Nab2-Protein ist ein transkriptioneller
Korepressor der für die Wachstums- und Differenzierungsregulation
wichtigen Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren Egr1, Egr2 und Egr3.
Das sind immediate early response-Gene, die durch die selben
Stimuli induziert werden wie Nab2. Nach Stimulation wird die
Expression von Egr deswegen grundsätzlich von einem Anstieg der
Nab2-Expression gefolgt. Nab2 ist deswegen wahrscheinlich der
wichtigste Repressor der Egr-Aktivität und verhindert eine
übermäßige Stimulation von Egr-Zielgenen. Ziel dieser Arbeit war
es, die regulatorischen DNS-Abschnitte des Nab2-Gens zu isolieren
und genau zu charakterisieren. Am Nab2-Promotor sollten dann die
Ursachen für die Überexpression im Melanom untersucht und der
Mechanismus der Nab2-Induktion nach Stimulation identifiziert
werden. Dazu wurde die genomische Nab2-DNS in einer humanen
DNS-Bibliothek durch DNS-Hybridisierung identifiziert und daraus
isoliert. So konnte ein 7.391 bp langes DNS-Fragment kloniert
werden, das 1.845 bp der 5´-untranslatierten Region sowie die
gesamte, aus 7 Exons aufgebaute proteinkodierende Nab2-Sequenz
enthält. Durch in silico Analysen der 5´-untranslatierten Region
konnten eine putative Promotorregion von Position -705 bis -82 (+1
= Adenin des Startkodons), eine CpG Insel von Position -876 bis +82
aber keine klassischen Kernpromotorelemente wie eine TATA-Box oder
ein Inr-Element identifiziert werden. Der Nab2-Promotor gehört
deshalb zur Klasse der TATA- und Inr-losen CpG-Insel-Promotoren.
Durch eine Kombination aus EST- und cDNS-Kartierungen sowie
Primerextensionsversuchen konnte ein sehr großes
Transkriptionsstartareal identifiziert werden, das sich von
Position -366 bis -96 erstreckt. Um funktionelle Studien mit der
5´-untranslatierten Nab2-Region durchzuführen wurden 17
verschiedene 5´-verkürzte Abschnitte daraus in
Luziferase-Reportervektoren kloniert und deren transkriptionelle
Aktivität in verschiedenen Zelllinien untersucht. Für das Erreichen
der maximalen Promotoraktivität (ca. dem 400fachen der Aktivität
des Leervektors) war der Sequenzabschnitt stromabwärts von Position
-679 ausreichend. Ab Position -58 war dann keine Promotoraktivität
mehr detektierbar. Der Nab2-Promotor erstreckt sich also von
Position -679 bis -58. Der Kernpromotor konnte aufgrund der
Lokalisation der Transkriptionsstartpunkte (-366 bis -96) und des
3´-Endes des Promotors (-58) zwischen Position -366 und -58
eingegrenzt werden. Die sehr hohe Aktivität des gesamten
Nab2-Promotors wird durch die aktivierende Region von Position -679
bis -263 hervorgerufen. Durch diesen DNS-Abschnitt steigt die
Aktivität vom 15- bis 30fachen auf das ca. 400fache der Aktivität
des Leervektors. In dieser positiven regulatorischen Region konnten
10 putative Sp1-Bindestellen identifiziert werden, die mit hoher
Wahrscheinlichkeit zu dem Aktivitätszuwachs beitragen. Um die
Ursache der Überexpression von Nab2 in Melanomzelllinien zu
Untersuchen, wurde die Aktivität der Nab2-Reporterkonstrukte in
Melanomzelllinien, die Nab2 überexprimieren, und in
Karzinomzelllinien, die nur wenig Nab2 exprimieren, verglichen. Die
Reporterkonstukte zeigten jedoch in Melanom- und Karzinomzelllinien
ungefähr die gleiche Aktivität. Die Ursache für die Überexpression
in Melanomzelllininen konnte durch diese Versuche nicht
identifiziert werden. Schließlich wurde die Aktivität der
Reporterkonstrukte in unstimulierten und PMA stimulierten Zellen
verglichen. Durch die PMA-Stimulation stieg die Aktivität des
Nab2-Promotors auf das ca. 3fache der Basalaktivität an. Die
gesteigerte Nab2-Expression nach Stimulation wird demnach auf der
Transkriptionsebene reguliert. Anhand der Verkürzungskonstrukte
konnte ein 19 bp langer DNS-Abschnitt zwischen Position -232 und
-213 identifiziert werden, der diesen Anstieg der Promotoraktivität
nach Stimulation hervorruft. In diesem Abschnitt liegen je eine
Egr1- und Sp1-Bindestelle, die sich teilweise überlappen. Bei
Kotransfektion eines Egr1-Expressionsvektors mit den
Nab2-Reporterkonstrukten konnte ein Aktivitätsanstieg
vergleichbarer Größenordnung wie durch PMA-Stimulation beobachtet
werden. Wurde die Egr1-Bindestelle an Position -222 durch Mutation
inaktiviert, so nahm die Induzierbarkeit des Nab2-Promotors durch
PMA um 35-50% und durch Egr1-Kotransfektion um 64-73% ab. Diese
Daten zeigen, dass Egr1 alleine in der Lage ist, den Nab2-Promotor
maximal zu aktivieren und dass dieser Effekt vorwiegend über die
Egr1-Bindestelle an Position -222 vermittelt wird. Weil der
Promotor aber nach der Inaktivierung der Egr1-Bindestelle an
Position -222 noch durch PMA und durch Egr1-Kotransfektion
aktivierbar ist, sind weitere Egr1-Bindestellen und womöglich noch
andere Transkriptionsfaktoren an der Aktivierung beteiligt. Diese
Daten zeigen, dass der Transkriptionsfaktor Egr1 seinen eigenen
Korepressor Nab2 induziert. Funktionell liegt also ein negativer
Rückkoppelungs-Mechanismus vor, der eine überschießende
Egr1-Aktivität verhindert.