Funktionelle Charakterisierung der gamma-Sekretasekomponente PEN-2

Die gamma-Sekretase ist ein Proteasekomplex, der aus vier
Komponenten, Presenilin (PS), Nicastrin (NCT), APH-1 und PEN-2,
besteht und der die intramembranöse Prozessierung verschiedener Typ
I Transmembranproteine, einschliesslich des Alzheimer-assoziierten
beta-Amyloid Vorläuferproteins, katalysiert. In der vorliegenden
Arbeit wurden stabile PEN-2 RNAi-Knockdown Zellen (PEN-2KD) dazu
verwendet, um Hinweise auf die Funktion von PEN-2 bei der
Assemblierung und Reifung des gamma-Sekretasekomplexes, die Rolle
von PEN-2 im aktiven Komplex und für die gamma-Sekretaseaktivität
zu erhalten. Zusätzlich wurden, vor dem Hintergrund des PEN-2KD,
RNAi-resistente PEN-2 Varianten analysiert, die in einer Struktur-
/Funktionsanalyse auf ihre Fähigkeit hin untersucht wurden, den
Defekt des PEN- 2KD aufzuheben, um damit funktionell wichtige
Domänen im PEN-2 Protein zu identifizieren. Der Knockdown von PEN-2
war mit gestörter Reifung von NCT und blockierter PS Endoproteolyse
assoziiert. PS akkumulierte als Vollängenprotein (PSholo), das
durch Komplexbildung mit NCT und APH-1 stabilisiert wurde. In
Abwesenheit von PEN-2 können PS, NCT und APH-1 zu einem trimeren
Komplex assemblieren, PEN- 2 ist danach allerdings notwendig, um
die Reifung des gamma-Sekretasekomplexes durch Initialisierung der
PS Endoproteolyse einzuleiten. Interessanterweise bewirkte der
Knockdown von PEN-2 auch in Endoproteolyse defizienten SwAPP/PS1
deltaExon9 Zellen einen Defekt in der Reifung von NCT. Dies schlägt
eine generelle Rolle von PEN-2 bei der Reifung und für die
Aktivität der gamma-Sekretase vor, die unabhängig von der PS
Endoproteolyse ist. Die Defekte des PEN-2KD konnten effektiv durch
RNAi-resistentes wt-PEN-2 revertiert werden. In der folgenden
Struktur-/Funktionsanalyse erwies sich am N-Terminus mit einem
Epitop-tag verlängertes PEN-2 als voll funktionell, wohingegen
sowohl die Verlängerung des C-Terminus mit einem tag, als auch eine
Trunkierung des C-Terminus (PEN-2 deltaC) defekte PEN-2 Varianten
hervorrief. Diese konnten zwar die Akkumulation von PSholo, die mit
dem Knockdown von PEN-2 assoziiert war ausgleichen, konnten aber
weder normale Spiegel an PS-NTF und -CTF herstellen, noch für eine
Reifung von NCT sorgen. PEN-2 deltaC war sehr instabil und wurde
schnell vom Proteasom abgebaut, was mit der Unfähigkeit einen
stabilen gamma-Sekretasekomplex zu bilden konsistent war.
Zusätzlich verursachte die Expression von PEN-2 deltaC eine
selektive Instabilität des PS-NTF/-CTF Heterodimers, das ebenfalls
vom Proteasom abgebaut wurde, wohingegen NCT und APH-1 stabil
blieben. Der C-Terminus von PEN-2 ist nicht für die Einleitung der
PS Endoproteolyse notwendig. Danach wird er allerdings benötigt um
die entstandenen PS Fragmente und PEN-2 selbst im Komplexzu
stabilisieren. Um den PEN-2 C-Terminus genauer zu untersuchen,
wurden unterschiedliche Deletionen und Mutationen mehrerer
konservierter Aminosäuren, im PEN-2KD auf funktionelle Aktivität
hin analysiert. Progressive Verkürzung des C-Terminus bewirkte
einen zunehmenden Funktionsverlust. Dieser wurde auch bei einer
internen Deletion oder der groben Verdopplung der Länge durch einen
Epitop-tag beobachtet. Interessanterweise störte nur die
kombinierte, nicht aber die einzelne Mutation der konservierten
Aminosäuren D90, F94, P97 und G99 die Funktion von PEN-2. Alle
funktionslosen Mutanten erlaubten zwar die PS Endoproteolyse, die
PS Fragmente und PEN-2 selbst waren aber instabil und wurden durch
das Proteasom abgebaut. Länge und gesamter Sequenzkontext des PEN-2
C-Terminus sind also, in der engen räumlichen Anordnung der
Komplexpartner, für die Stabilisierung des PS-NTF/- CTF
Heterodimers und von PEN-2 selbst im gamma-Sekretasekomplex
notwendig. Die Interaktion der C-terminalen PEN-2 Mutanten mit den
PS Fragmenten und den anderen beiden Komplexpartnern konnte
allerdings unter Bedingungen, wo der proteasomale Abbau blockiert
war, wiederhergestellt werden. Somit wurde ein Komplex aus allen
vier essentiellen gamma-Sekretasekomponenten stabilisiert und
isoliert, der zwar vollständig assembliert, aber noch nicht
komplett gereift war. Dieser prämature Komplex zeigte noch keine
gamma-Sekretaseaktivität, für welche sowohl die vollständige
Assemblierung der Komponenten, als auch deren komplette Reifung
essentiell sind. Zusammenfassend schlagen die vorliegenden Daten
folgende Funktionen für PEN- 2 im gamma-Sekretasekomplex vor: PEN-2
wird für die Reifung des gamma-Sekretasekomplexes und die
Einleitung der PS Endoproteolyse benötigt. Darüber hinaus
stabilisiert PEN-2 die, durch die Endoproteolyse entstandenen PS
Fragmente im Komplex. Für letztere Funktion ist ein in Länge und
Gesamtsequenzkontext intakter C-Terminus wichtig, der allerdings
für die Einleitung der PS Endoproteolyse nicht benötigt wird.
Unabhängig von der Rolle bei der PS Endoproteolyse ist PEN-2 aber
generell für die Reifung und Aktivität des gamma-Sekretasekomplexes
wichtig.