Aberrante Aktivierung der Rezeptortyrosinkinase FLT3 in der akuten myeloischen Leukämie

In der akuten myeloischen Leukämie (AML) sind zwei Cluster
aktivierender Mutationen im ´FMS-like tyrosine kinase-3´ (FLT3)-Gen
bekannt: FLT3-´internal tandem duplications´ (FLT3-ITD) in der
juxtamembranösen (JM)-Domäne in 20 - 25 % der Patienten und
FLT3-Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäne (FLT3-TKD) in 7 –
10 % der Patienten. In dieser Studie haben wir eine neue Klasse
aktivierender Punktmutationen (PM) charakterisiert, die in einem
16-Aminosäuren-Abschnitt der JM-Domäne von FLT3 (FLT3-JM-PM)
lokalisiert sind. Die Expression von vier FLT3-JM-PM in
IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen führte zu wachstumsfaktor-unabhängigem
Wachstum, Hyperproliferation in Gegenwart von FL und Resistenz
gegenüber apoptotischem Zelltod. FLT3-JM-PM-Rezeptoren waren
autophosphoryliert und zeigten verglichen mit FLT3-WT-Rezeptoren
eine höhere konstitutive Dimerisierungsrate. Als einen molekularen
Mechanismus konnten wir die Aktivierung von STAT5 und eine erhöhte
Expression von Bcl-x(L) in allen FLT3-JM-PM-exprimierenden Zellen
im Vergleich zu FLT3-WT-Zellen zeigen. Der FLT3-Inhibitor PKC412
inhibierte das wachstumsfaktor-unabhängige Wachstum der
FLT3-JM-PM-Zellen. Verglichen mit FLT3-ITD- und FLT3-TKD-Zellen,
zeigten die FLT3-JM-PM-Zellen ein schwächeres
Transformationspotential, verbunden mit geringerer
Autophosphorylierung des Rezeptors und dessen nachgeordneten
Ziel-Protein STAT5. Die Kartierung der FLT3-JM-PM auf die
Kristallstruktur des FLT3-Proteins zeigte, dass diese
Punktmutationen wahrscheinlich die Stabilität der
autoinhibitorischen JM-Domäne reduzieren. Dies liefert eine
strukturelle Erklärung für das transformierende Potential dieser
neuen Klasse aktivierender Mutationen von FLT3. Die defekte
Negativ-Regulation aktivierter Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) ist
ein bekannter Mechanismus der Onkogenese. Die RTK FLT3 wird in
frühen myeloischen und lymphoiden Progenitorzellen exprimiert und
ist an der Pathogenese der AML beteiligt. Das ´Casitas B-lineage
lymphoma´ (CBL)-Protein ist in der Evolution stark konserviert und
übernimmt wichtige Funktionen in der Negativ-Regulation der
Signalübertragung verschiedener Zelloberflächenrezeptoren. Zwei
CBL-Deletionsmutanten, die in vitro Fibroblasten transformieren,
wurden aus murinen Retroviren isoliert, die
Vorläufer-B-Zelllymphome induzieren. In dieser Arbeit konnte
gezeigt werden, dass CBL nach FL-Stimulierung von
FLT3-WT-exprimierenden Ba/F3-Zellen phosphoryliert wird und damit
in die FLT3-nachgeordnete Signaltransduktion involviert ist. Die
Koexpression der CBL-Deletionsmutanten CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3
führt zur Transformation von Ba/F3-Zellen. Das transformierende
Potential wird durch den FLT3-Rezeptor vermittelt, da die
selektiven FLT3-PTK-Inhibitoren SU5614 und PKC412 die Proliferation
der FLT3-WT/CBL-mutanten-Zellen vollständig aufheben. Die
Aktivierung des PI3K/mTOR/AKT-Signalweges, jedoch nicht der
SRC-Kinasen und MAPK, trägt wesentlich zum hyperproliferierenden
Phänotyp der FLT3-WT/CBL-mutanten Zellen nach Ligandenstimulierung
bei. Die Koexpression von CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur
konstitutiven Aktivierung der FLT3-Rezeptoren sowie STAT5 und AKT.
Nach FL-Stimulierung konnten wir eine Hyperaktivierung von STAT5
und AKT in FLT3-WT/CBL-70Z und FLT3-WT/v-CBL-Zellen beobachten. An
der Interaktion von CBL und FLT3 sind die TKB-Domäne des
CBL-Proteins und die JM-Tyrosine Y589 und Y599 des FLT3-Rezeptors
beteiligt. Die Internalisierung der FLT3-Rezeptoren wird durch die
Koexpression von CBL-70Z nicht verändert. Allerdings ist CBL an der
Ubiquitinierung und Degradierung von Rezeptoren beteiligt und wir
konnten zeigen, dass CBL-WT die Dephosphorylierung und Degradierung
des FLT3-Rezeptors fördert. Es wurde vorgeschlagen, dass die
CBL-Deletionsmutanten in dominant-negativer Weise agieren und die
negativ-regulatorische Funktion von CBL-WT blockieren. Wir haben
eine CBL-Deletionsmutante in den AML Zelllinie MOLM-13 und MOLM-14
identifiziert. Dieser CBL-Mutante fehlt Exon 8, das für Teile der
Linker- und RING-Finger-Domäne kodiert, und erinnert an CBL-70Z.
Die Entdeckung einer möglicherweise transformierenden CBL-Mutante
in AML-Zellen unterstützt die Hypothese, dass CBL zum malignen
Phänotyp der AML beiträgt. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass
die strukturelle oder funktionelle Inaktivierung
negativ-regulatorischer Mechanismen das transformierende Potential
von FLT3 aktivieren kann: 1. Der Verlust der Autoinhibition durch
Punktmutationen, die die geordnete Konformation der
autoinhibitorischen JM-Domäne stören. 2. Die funktionelle
Inaktivierung eines negativ-regulatorischen Proteins durch
´loss-of-function´-Mutationen. Diese Daten unterstreichen die
zentrale Rolle von FLT3 in der Leukämogenese und als ein
Zielprotein für therapeutische Ansätze.