Analyse von Histonmethyltransferasen

In der vorgelegten Arbeit wurden Histonmethyltransferasen
untersucht. Die beiden SET-Proteine, Enhancer of Zeste (E(z)) und
PRset7 methylieren jeweils spezifische Lysine in den N-Termini der
Histonmoleküle H3 bzw. H4 und wurden zu Beginn in E. coli
exprimiert. In Histonmethyltransferase-(HMTase)-Versuchen konnte
mit E(z) keine Aktivität erzielt werden. Mit einer eingeführten
Mutation des aktiven Zentrums („E(z)mut“) und mit E(z) konnte nach
der Inkubation mit Drosophila-Kernextrakten an beiden Proteinen die
Histondeacetylase Rpd3 nachgewiesen werden, die enzymatisch aktiv
war. Unsere Arbeitsgruppe konnte die HMTase-Aktivität eines
E(z)-Komplexes bestätigen, die von einer (nicht-mutierten)
SET-Domäne abhängt (Czermin et al., 2002). Die Untersuchungen zur
Histonmethyltransferase PRset7 begannen mit Aktivitäts- und
Spezifitätsversuchen an verschiedenen Substraten. Die nukleosomale
Spezifität von PRset7 bestätigte sich gemäß den Ergebnissen von
Fang et al. und Nishioka et al. (Fang et al., 2002; Nishioka et
al., 2002b). PRset7 unterschied klar zwischen rekombinanten
Nukleosomen (Histone rekombinant in E.coli exprimiert) und nativen
Nukleosomen (Histone aus Drosophila-Embryos gereinigt), wobei
letztere deutlich vermindert methyliert wurden. An rekombinanten,
mit PRset7 methylierten Nukleosomen, konnte mit einem H4
K20-methyl-Antikörper eine H4 K20-Methylierung detektiert werden.
Mit Hilfe verschiedener, rekombinanter Nukleosomen, deren
H4-Moleküle N-terminal unterschiedlich lang waren, konnte die
Substraterkennung bzw. -bindung von PRset7 auf maximal 9
Aminosäuren vor Lysin 20 eingegrenzt werden. Durch die Reinigung
des Proteins wurde deutlich, dass kürzere Degradationsprodukte von
PRset7 den wesentlichen Anteil der detektierten HMTase-Aktivität
ausgemacht hatten, ohne die hohe nukleosomale Substratspezifität zu
verlieren. Für die Substratherstellung weiterer in vitro-Versuche
zur Beziehung zwischen H4-Acetylierung (K12 bzw. K16) und
H4-Methylierung (K20) wurde die Histonacetyltransferase MOF
rekombinant hergestellt, gereinigt und die enzymatische Aktivität
bestätigt. Es ergab sich keine eindeutige positive oder negative
gegenseitige Beeinflussung der beiden Modifikationen. Abschließend
wurden die verwendeten Antikörper bezüglich ihrer Spezifität
untersucht, welche gegeben war.