Modulation der DNA-Mechanik durch Methylierung und Transkriptionsfaktoren

Genregulation gibt der Zelle die Kontrolle über Struktur und
Funktion, und ist die Basis für zelluläre Differenzierung,
Morphogenese und die Vielseitigkeit und Anpassungsfähigkeit von
jedem Organismus. Um zu begreifen, wie eine Zelle ihre Funktion
organisiert und wie sich ganz individuelle Organismen ausbilden,
obwohl die gleichen genetischen Informationen vorhanden sind, muss
man die Regulation der Genexpression im Detail verstehen. Diese
Regulation wirkt an verschiedenen Stellen der Genexpression und
besteht aus einer Vielzahl von komplexen Prozessen, die
untereinander verbunden sind. Somit ist das Verständnis der
zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und ihres Zusammenspiels
für Biologie und Biophysik von großer Bedeutung. Ziel dieser Arbeit
ist die Untersuchung von Wechselwirkungen und
Wechselwirkungskräften zwischen Biomolekülen, die an der
Genregulation und der Epigenetik, auf der Ebene der Transkription
beteiligt sind. Insbesondere konnten Protein-DNA-Wechselwirkungen
und der Einfluss epigenetischer DNA-Modifikationen quantifiziert
werden. Für die Messungen wurde ein molekularer Kraftsensor und als
dessen Erweiterung ein molekularer Analog-Digital-Wandler
entwickelt. Diese molekularen Sensoren ermöglichen die direkte
Messung der Wechsel- wirkungskräfte zwischen DNA und Liganden. Mit
dem molekularen Kraftsensor können außerdem hochparallel Messungen
durchgeführt werden, wobei durch den symmetrischen, molekularen
Aufbau zudem eine sehr hohe Sensitivität erreicht wird. Die
Verwendung dieser Methode ermöglichte es, den Einfluss der
epigenetisch modifizierten Basen Methylcytosin und
Hydroxymethylcytosin („5. und 6. Base der DNA“) auf die mechanische
Stabilität der DNA- Doppelhelix zu untersuchen. Es wird gezeigt,
dass mit dem aus DNA-Oligomeren aufgebauten molekularen Kraftsensor
Protein-DNA-Wechselwirkungen detektiert und deren
Dissoziationskonstanten bestimmt werden können. Unter anderem wird
die Wechselwirkung der Endonuklease EcoRI mit ihrer DNA-
Erkennungssequenz quantifiziert. Hierfür wurden molekulare
Kraftsensoren in Zipper- und Scher-Geometrie entworfen. Bei dem neu
entwickelten Aufbau des Kraftsensors mit integriertem
Förster-Resonanzenergietransfer-Farbstoffpaar genügt schon eine
Fläche von 25 !m2, um die Stärke von Ligand-DNA-Wechselwirkungen
bestimmen zu können. Diese Fläche liegt deutlich unterhalb der
Messfleckgröße aktueller DNA-Mikroarrays. Damit erfüllt der
molekulare Kraftsensor bezüglich der Messfleckdichte die
Voraussetzung für moderne Hochdurchsatz- Methoden. In einem zweiten
Schritt wird der molekulare Kraftsensor zu einem „molekularen
Analog- Digital-Wandler“ erweitert. In Analogie zum elektronischen
Flash-Analog-Digital-Wandler, bei dem mehrere Komparatoren mit
unterschiedlichen Referenzschaltungen parallel geschaltet sind,
werden beim molekularen Analog-Digital-Wandler parallel räumlich
getrennte, molekulare Kraftsensoren mit unterschiedlich stabilen
Referenz-Wechselwirkungen zur Bestimmung einer unbekannten
molekularen Wechselwirkung verwendet. Durch eine
Kompensationsmessung wird dann die Kraft von
Ligand-DNA-Wechselwirkungen bestimmt. Es werden die Wechsel-
wirkungen eines Pyrrol-Imidazol Hairpin-Polyamides, der
Endonuklease EcoRI und des Transkriptionsfaktors p53 zur jeweiligen
DNA-Erkennungssequenz vermessen. Eine hoch- parallele Version mit
Messfleckgrößen mit einem Durchmesser von minimal 15 !m konnte
realisiert werden. Abgeleitet vom Bell-Evans-Modell wurde ein
analytisches Modell zur Beschreibung des molekularen
Analog-Digital-Wandlers entwickelt. Neben den
Protein-DNA-Wechselwirkungen werden die epigenetisch modifizierten
DNA- Basen Methylcytosin (mC) und Hydroxymethylcytosin (hmC)
untersucht. Es wird der Nachweis erbracht, dass sich die
mechanische Stabilität der DNA-Doppelhelix bei Separation in zwei
Einzelstränge in beiden Fällen signifikant um mehrere Pikonewton
ändert. Die Stärke des Effekts ist abhängig von der DNA-Sequenz und
der Richtung der angelegten Kraft. Durch
Einzelmolekül-Kraftspektroskopie wird eine Reduzierung der
Potentialweite durch mC aufgezeigt. Außerdem konnte mit Hilfe von
Molekulardynamik-Simulationen der Effekt für mC und teilweise auch
für hmC auf molekularer Ebene aufgeklärt werden. Es wird ein Modell
entwickelt, das erklärt, wie dieser Effekt einen Einfluss auf die
Genregulation ausüben kann.