Thermophoresis and cooperative binding of nucleotides

Thermophorese beschreibt die von Temperaturegradienten
angetriebene, gerichtete Bewegung von Partikeln. Obwohl dieser
Effekt seit 1856 bekannt ist, werden die zugrundeliegenden
Prinzipien immer noch aktiv diskutiert. Im ersten Teil dieser
Arbeit wurde ein lange vorhergesagter größenabhängiger Übergang der
Thermophorese zum ersten Mal experimentell verifiziert. Die
Experimente untersuchen ein sphärisches Kondensator Modell für
Thermophorese. Um Vorhersagen über ionisches Abschirmen geladener
Partikel zu testen, sind Nanopartikel erforderlich, deren Größe im
Bereich der Debye Länge liegt: DNA und RNA Oligonucleotide. Der
theoretisch prognostizierte Übergang vom Plattenkondensator- über
das sphärische Kondensator- bis hin zum isolierte Sphäre-Modell
wurde über einen weiten Bereich von Verhältnissen zwischen
Partikelgröße und Debye Länge erfolgreich beobachtet. Die
Kombination dieser ionischen Thermophorese mit einer etablierten
Beschreibung der Temperaturabhängigkeit von Thermophorese von
ungeladenen Partikeln reicht aus, um Thermophorese von einzel- und
doppelsträngiger DNA und RNA von 5°C bis 75°C und unter
Salzkonzentrationen von 0.5mM bis 500mM abzudecken. Dies umfasst
einen Großteil biologisch relevanten Bedingungen. Damit lassen sich
nicht triviale Abhängigkeiten der Thermophorese in sehr breiten
Bereichen von Salzkonzentration und Temperaturen für hoch relevante
DNA und RNA Längen mit dem bestätigten Modell vorausberechnen.
Diese Experimente geben neue Impulse in der Diskussion über die
Rolle von sekundären elektrischen Feldern bei der Thermophorese.
Zudem kann dieses neu gewonnene theoretische Verständnis die
Quantifizierung von Biomolekülaffinitäten verbessern. Kooperatives
Binden, das im zweiten Teil untersucht wird, ist entscheidend für
das Verständnis vieler intrazellulärer Prozesse wie z.B. der
Transkription. Mithilfe von Thermophoresemessungen wird das
komplette Bindungsverhalten von mehr als zwei Partnern inklusive
der kooperativen Effekte untersucht, die komplexe
Molekül-Interaktionen formen. Die hier präsentierte, neu
entwickelte Prozedur ist sehr flexibel und setzt nur einen
fluoreszierzmarkierten Bindungspartner voraus. Im Gegensatz zu
Methoden, die auf der Sättigung einer Bindung bei gleichzeitiger
Untersuchung einer anderen beruhen, macht dieser neue Ansatz viele
zusätzliche kooperative Molekülsysteme zugänglich. Kooperatives
Binden eines sternförmigen, dreiteiligen DNA-Komplexes wird mit
einer einzigen Messung aufgedeckt. Bindungskonstanten und
thermophoretische Eigenschaften der Komplexe werde mit Messungen
von Titrationsreihen innerhalb des Konzentrationswürfels
untersucht. Diese Methode kann zu einer bisher fehlenden, flexiblen
Messtechnik für kooperative Effekte bei geringer Veränderungen der
untersuchten Systeme werden.