Untersuchungen zur Yersinia enterocolitica-stimulierten Genexpression in Epithelzellen

Epithelzellen spielen im Immunsystem eine wichtige Rolle als
Vermittler zwischen äußerem Milieu und darunterliegender Mukosa.
Epithelzellen treten als Erste mit potentiellen Pathogenen in
Kontakt: durch die Sekretion von Zytokinen als Warnsignale an
umliegende Zellen können sie eine Entzündungsreaktion einleiten.
Yersinia enterocolitica ist ein enteropathogener, vorwiegend
extrazellulär lokalisierter Erreger, der eine akute Enterokolitis,
Sepsis und immunologische Folgeerkrankungen verursacht. Die Rolle
der intestinalen Epithelzellen bei der Infektion mit Y.
enterocolitica ist bisher nicht ausreichend erörtert. Ziel dieser
Arbeit war zum einen die Untersuchung des von Epithelzellen
initiierten Zytokin-Netzwerks während der frühen Phase der Y.
enterocolitica- Infektion. Hierzu wurden HeLa-Zell-Monolayer mit
verschiedenen Y. enterocolitica- Stämmen infiziert und mittels
Reverser Transkriptions (RT)-PCR zunächst wichtige Zytokine
identifiziert. Die Kinetik der Zytokin-Produktion wurde durch
semiquantitative RT-PCR analysiert sowie die intra- oder
extrazelluläre Lokalisation der Zytokine mittels ELISA quantitativ
erfasst. Die Stimulation von epithelialen Zellen mit rekombinanten
humanen Zytokinen lieferte weitere Informationen über die Funktion
der einzelnen Zytokine. Zum anderen wurden die Mechanismen der
Wirt-Pathogen- Interaktion analysiert, die das Zytokin-Netzwerk
während der initialen Phase der Y. enterocolitica-Infektion
auslösen. Die Auswirkungen der Hemmung der bakteriellen Invasion
(durch PI3-Kinase-Inhibitoren) sowie der bakteriellen
Proteinsynthese (mittels Antibiotika) wurden untersucht. Durch die
Infektion von Epithelzellen mit verschiedenen bakteriellen
Mutantenstämmen gelang es, die Bedeutung des chromosomal kodierten
Oberflächenproteins Yersinia Invasin zu charakterisieren. Folgende
Ergebnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit erzielt: 1. Y.
enterocolitica pYV– induziert eine Stunde nach Infektion von
HeLa-Zellen die de novo-Synthese von IL-8-, IL-1a-, MCP-1-, IL-1b-,
GM-CSF- und TNF-a- mRNA. Y. enterocolitica pVY+ hemmt durch
bestimmte Yersinia outer proteins die de novo-Synthese aller
untersuchten Zytokine in HeLa-Zellen. 2. Die
Zytokin-mRNA-Produktion in HeLa-Zellen nach Y. enterocolitica
pYV–-Infektion erreicht nach 3 h ihr Maximum, um 5–6 h nach
Infektion wieder auf Normalwerte abzufallen. IL-8 wird hierbei als
Erstes und in den größten Mengen produziert. Diese
pro-inflammatorische Zytokin-Antwort ist wahrscheinlich
verantwortlich für den histopathologisch beobachteten massiven
Einstrom von Immunzellen in infizierte Peyer’sche Plaques, was
deren Zerstörung zur Folge hat. 3. Nur IL-8, MCP-1 und GM-CSF
werden von HeLa-Zellen sekretiert, IL-1a und IL-1b verbleiben
intrazellulär. IL-1a stimuliert bei HeLa-Zellen eine
proinflammatorische Zytokin-Antwort, nicht jedoch IL-8, MCP-1 oder
GM-CSF. Dies spricht für eine spezielle Rolle von IL-1: es könnte
als ‚Verstärker-Zytokin’ dienen, das erst im späteren Verlauf der
Infektion, nach Lyse der infizierten Zellen, freigesetzt wird und
eine erneute Zytokin-Produktion verursacht. 4. Die
Zytokin-Induktion nach Y. enterocolitica-Infektion von HeLa-Zellen
ist wahrscheinlich nicht LPS-vermittelt. 5. Auch nach Hemmung der
bakteriellen Invasion durch Wortmannin, einem PI3-
Kinase-Inhibitor, beobachtet man die gleichen Zytokin-Antwort:
schon die Adhäsion der Bakterien an die Wirtszelle genügt, um eine
inflammatorische Zytokin- Reaktion auszulösen. 6. Wir zeigten, dass
die Zytokin-Induktion durch die Bindung von Yersinia Invasin an
b1-Integrine der Wirtszelle vermittelt wird: Eine
Invasin-defiziente Y. enterocolitica- Mutante löst (ebenso wie ein
nicht-invasiver E. coli-Stamm) keine Zytokin- Reaktion in
HeLa-Zellen aus. Der Transfer des Invasin-Gens in E. coli hingegen
vermittelt diesem die Fähigkeit, eine inflammatorische
Zytokin-Antwort auszulösen. 7. Die Invasin-induzierte
Zytokin-Antwort nach Y. enterocolitica pYV– ist unabhängig von
bakterieller Proteinbiosynthese oder einem intakten Typ
III-Sekretionssystem: auch Gentamicin- oder Hitze-getötete
Yersinien induzieren eine inflammatorische Zytokin-Antwort wie
metabolisch aktive Yersinien. Diese Ergebnisse verdeutlichen zum
einen die wichtige Rolle von Epithelzellen bei der Generierung von
Signalen zur Initiation der Abwehrreaktion des Immunsystems gegen
Y. enterocolitica. Zum anderen wurde Yersinia Invasin als
Pathogenitätsfaktor charakterisiert, der gezielt eine zelluläre
Entzündungsreaktion der Darmmukosa auf eine Y.
enterocolitica-Infektion initiiert.