Expression eines rekombinanten humanen Proteins in vitro und in vivo in Eileiterzellen des Huhnes, am Beispiel von humanem Erythropoietin, hrEPO

Die Produktion heterologer, medizinisch verwertbarer Proteine in
Tieren ist heute ein Standardverfahren und viele Spezies haben sich
als hierfür geeignet erwiesen. Das Huhn sollte sich besonders als
Bioreaktor eignen, es verfügt zum einen über kurze
Generationszeiten, und in seinem Eileiter werden täglich grosse
Mengen Protein gebildet und im Ei ausgeschieden. Dennoch war es bis
heute, trotz zahlreicher Anstrengungen von verschiedenen
Arbeitsgruppen nicht gelungen, den Organismus eines Huhnes
genetisch derart zu verändern, dass ein heterologes Protein im
Eileiter gebildet, und im Ei nachweisbar ausgeschieden wird. Im
Rahmen der Experimente, die in dieser Dissertation vorgestellt
werden, ist es erstmals gelungen im Eileiter des Huhnes ein
heterologes Protein, EPO, zu exprimieren. Es konnte nachgewiesen
werden, dass das Protein aus den Zellen des Eileiters ausgeschleust
wird und schliesslich im gelegten Ei in grosser Menge zu finden
ist. Hierzu wurden geeignete Genkonstrukte kloniert, in vitro in
primären Eileiterzellen getestet, und schliesslich per
Gengun-Verfahren in vivo in den Eileiter eingebracht. Die
Expression erfolgte unter der Kontrolle des viralen CMV-Promotors,
das EPO-Protein war in den Eiern der positiv getesteten Tieren über
Wochen nachweisbar. Aufgrund dieses Erfolges wurde versucht eine
gewebespezifische Expression unter der Kontrolle des
Ovalbuminpromotors zu erreichen. Es gelang ein geeignetes
Promotorkonstrukt zu identifizieren und zu klonieren, sowie in
vitro eine gewebespezifische Expression von ß-Galactosidase zu
erreichen, eine Expression von EGFP und EPO konnte jedoch nicht
sicher nachgewiesen werden. Ursächlich hierfür ist das komplexe
Regulierungssystem des Ovalbuminpromotors, das durch
Transfektionsverfahren empfindlich gestört wird und in
vitro-Versuche beinahe unmöglich macht. Unter zu Hilfenahme eines
alternativen Transfektionsverfahrens, der Virofektion gelang es
jedoch unter der Kontrolle des Ovalbuminpromotors in vivo einmalig
EPO-Expression in das Hühnerei nachzuweisen. Experimente, die nach
Abschluss der Arbeiten an dieser Dissertation durchgeführt wurden,
haben die Funktionsfähigkeit der retroviralen Konstrukte bestätigt.
Insbesondere konnte unter der Kontrolle des Ovalbuminpromotors eine
zellspezifische Expression von ErythropoietinErythropoietin wird
aktuell auf seine biologische Aktivität untersucht, die
Veröffentlichung der Ergebnisse befindet sich in Vorbereitung.
erreicht werden, die Transfektion hat sich als stabil erwiesen. Das
so gewonnene