Endotheliale Superoxidanionen–Bildung

Reaktive – Sauerstoff - Spezies (ROS) spielen in der Physiologie
und Pathophysiologie des vaskulären Systems eine wichtige Rolle. So
kommt es z.B. bei Hypertonie, Atherosklerose, Ischämie /
Reperfusion und weiteren Krankheiten und Stoffwechselstörungen, wie
z.B. Hypercholesterinämie und Diabetes mellitus zu einem
Ungleichgewicht zwischen Sauerstoffradikalbildung und anti -
oxidativen Mechanismen. Superoxidanionen (O2 -) spielen insofern
eine besondere Rolle, als sie durch direkte Interaktion
endotheliales NO inaktivieren, so daß es seine vasodilatatorische,
anti – proliferative und plättchenaggregationshemmende Funktion
nicht mehr voll erfüllen kann. Damit ist O2 - maßgeblich an der
Induktion der Endotheldysfunktion beteiligt. Bei Beginn dieser
Arbeit gab es erste Hinweise, daß eine der leukozytären NAD(P)H -
Oxidase ähnlichen Oxidase auch im Endothel existiert und wesentlich
zur endothelialen O2 - - Bildung beiträgt. Wenig erforscht waren
jedoch die Regulationsmechanismen dieser Oxidase. Ein bisher noch
nicht bekannter Stimulus zur Steigerung der endothelialen O2 - -
Bildung wurde 1996 beschrieben. In Endothelzellen aus bovinen
Pulmonararterien führte eine Depolarisation zu einer gesteigerten
O2 - - Bildung. Dies kann insofern von Bedeutung sein, als es
sowohl unter physiologischen, als auch pathophysiologischen
Bedingungen zu akuten oder chronischen Veränderungen des
endothelialen Membranpotentials kommt. In dieser Arbeit wurde nun
untersucht, ob eine NAD(P)H – Oxidase in der Tat auch in humanen
Endothelzellen vorhanden ist, ob sie im Gegensatz zur leukozytären
Form konstitutiv aktiv ist, und welchen Beitrag sie zur basalen
endothelialen O2 - - Bildung leistet. Weitere Untersuchungen in
HUVEC sollten zeigen, ob und wie sich sowohl De – als auch
Hyperpolarisation der Zellmembran auf die O2 - - Bildung auswirken,
welches Enzym hierbei eine Rolle spielt und welche
Signaltransduktionsmechanismen beteiligt sind. Zur O2 - - Messung
an vaskulären Zellen war die Verwendung der Lucigenin –
Chemilumineszenz – Methode etabliert, so daß auch hier anfänglich
mit dieser Methode gearbeitet wurde. Da jedoch dann Befunde
veröffentlicht wurden, die zeigten, daß Lucigenin in
Enzymsyste-men, die sonst kein oder nur wenig O2 - produzieren, zu
einer erheblichen O2 - - Bildung führte, mußte mit weiteren
Methoden der O2 - - Messung überprüft werden, ob diese Nachteile
auch unter unseren Versuchsbedingungen auftraten. Verwendet wurden
hierzu die MCLA – verstärkte Chemilumineszenz, die NBT – und
Cytochrom C – Methode. Mit diesen verschiedenen, voneinander
unabhängigen Methoden zeigte sich, daß in Anwesenheit von NADH
Lucigenin selbst zu einer wesentlich gesteigerten O2 - - Bildung in
Lysaten von humanen Umbilikalvenenendothelzellen (HUVEC) führt.
Daher wurde zur Untersuchung der endothelialen O2 - - Bildung in
dieser Arbeit schließlich nur die Cytochrom C Methode verwendet.
Zur Überprüfung der Auswirkungen der verwendeten Substanzen auf das
Membranpotential wurde die Membranpotentialmeßmethode mittels dem
Potential – sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Bis - oxonol aufgebaut
und verwendet. Intakte HUVEC zeigten eine basale O2 - - Produktion,
die durch bekannte Inhibitoren der leukozytären NAD(P)H – Oxidase,
mit unterschiedlichen Wirkmechanismen signifikant gehemmt wurde
(Diphenyleniodonium ca. 48%, Phenylarsenoxid ca. 34% ). Ebenso
resultierte die Inaktivierung des GTP - bindenden - Proteins rac
mit Clostridium difficile Toxin B in einer signifikanten Reduktion
der basalen endothelialen O2 - - Produktion um ca. 30%. Weiterhin
konnte gezeigt werden, daß nach Aufhebung der zellulären Integrität
durch das Lysieren der HUVEC die Gabe von NADH eine um ca. 2.7 fach
erhöhte O2 - - Produktion im Vergleich zu NADPH bewirkte. Mit Hilfe
der Immunfluoreszenz bzw. rtPCR konnten außerdem zumindest ein Teil
der leukozytären NAD(P)H – Oxidase Untereinheiten, p67phox und
gp91phox auch in HUVEC nachgewiesen werden. Zur gezielten
Depolarisation des Membranpotentials wurden ein Puffer mit erhöhter
Kaliumkonzentration (90 mM), der nicht selektive Kalium – Kanal -
Blocker Tetrabutylammonium Chlorid (1 mM) und das Kation – Ionophor
Gramicidin (1 µM) verwendet. Die basale endotheliale O2 - -
Produktion wurde durch diese Substanzen in ähnlichem Ausmaß (~ 60%
) signifikant gesteigert (n=23, p