Physical properties of the plasma membrane studied by local probe techniques

Im Rahmen dieser Arbeit wurden physikalische Meßmethoden
entwickelt, um die Struktur und Dynamik der Plasmamembran lebender
Säugetierzellen zu untersuchen. Dabei lag der Schwerpunkt zum einem
auf der mechanischen Kopplung der Membranlipidschicht zu dem
darunter liegenden, unterstützend wirkenden Zytoskelett, und zum
anderen auf der Beweglichkeit einzelner Membrankomponenten
innnerhalb der Membranlipidschicht. Ausgangspunkte für die
Entwicklung neuer Methoden waren die Rasterkraftmikroskopie (RKM)
und ´single-particle tracking’ (SPT). Die RKMermöglicht die
Abbildung von Ober‡ächen mit hoher Au‡ösung in physiologischer
Umgebung, so lange die Wechselwirkungskräfte die Probenober‡äche
nicht zu sehr deformieren. SPT ist eine Technik, um die Bewegung
von einzelnen Molekülen zu verfolgen. Dafür werden diese mit
Polysteren-kügelchen oder kolloidem Gold markiert und mit
Videomikroskopie beobachtet. Auf diesen Techniken aufbauend wurden
folgende Verfahren und Geräte für diese Arbeit entwickelt: Das
Scanning-Photonic Force Microscope (SPFM) als Analogon zum RKM: In
einer Laserfalle (einem mit einem Objektiv hoher Apperatur (100x,
NA 1.3) fokussierten infraroten (IR) Laser) wird ein Fluorophor
gefülltes Polysterenkügelchen (bead, r=0.1¹m) gefangen. Die
Fluorophore des als Sonde verwendeten Kügelchens werden über einen
Zwei-Photonen Prozeß durch den IR-Laser zur Fluoreszenz angeregt.
Eine Auslenkung aus der Halteposition durch eine äußere Kraft führt
zum Abfall der Fluoreszenz. Im SPFM wird die Sonde mit Hilfe des
Lasers analog zum mechanischen Hebelarm im RKM über die Probe
bewegt. Dabei wird wie beim RKM die Auslenkung und somit Kraft
gemessen. Die wesentlichen Unterschiede sind die fehlende
mechanische Verbindung zur Umwelt, die ein Abrastern beliebiger
transparenter 3D-Strukturen ermöglicht, die extrem kleine
Federkonstante des Sensors (0.1- 1¹N/m), welche daher besser an die
Elastiztät von biologischen Objekten angepaßt ist, sowie die stark
reduzierte viskose Dämpfung der kleineren Sonde, was schnelleres
Messen ermöglicht. Das Photonic Force Microscope (PFM) ist die
Weiterentwicklung des SPFM. Bei der verwendeten kleinen
Federkonstante werden die thermischen Positions‡ uktuationen sehr
groß. Daher wurde ein Detektor entwickelt, der Messung der Position
der Sonde in der Falle in drei Dimensionen mit Nanometer
Ortsau‡ösung und 50kHz-Bandbreite ermöglicht. Der Detektor basiert
auf der Interferenz des an der Sonde vorwärts gestreuten
Laserlichts mit dem ungestreuten Licht. Dieses Prinzip wurde zuvor
nur für seitliche Auslenkungen entlang einer Achse verwendet und
erstmals in dieser Arbeit drei dimensional angewandt. Die
vollständige theoretische Beschriebung des Detektorsignals ist
ebenfalls ein Novum. Im PFM werden mit diesem Detektor die
thermischen 3D-Positions‡uktuationen einer durch den Laser in einem
Volumen von 0.1*0.1*0.6¹m3 gehaltenen Sonde analysiert. Zusätzlich
wirkende Potentiale und die Viskosität des umgebenden Mediums
können gemessen werden.