Kraftspektroskopie an lebenden Zellen

Das Kraftmikroskop hat sich in vieler Hinsicht als effizientes
Gerät für Untersuchungen und Manipulationen auf molekularer Ebene
erwiesen. Dabei wird selbst unter physiologischen Bedingungen eine
Auflösung erreicht, die Proteinsubstrukturen erkennen läßt. Als
Kraftspektroskop kann es mechanische Eigenschaften wie
Dehnungsverhalten und Reißfestigkeit einzelner Moleküle, die
zwischen der Sensorfeder und der Unterlage eingespannt werden,
untersuchen. Sogar die Bindungskräfte zwischen einem Molekül am
Kraftsensor und einem anderen am Substrat können mittels
Kraftspektroskopie mit etwa 3 pN Genauigkeit ermittelt werden. Von
besonderem Interesse solcher Untersuchungen sind Moleküle mit
spezifischer Affinität nach dem Schlüssel-Schloß-Prinzip, wie
Rezeptor-Ligand- Systeme und Adhäsionsmoleküle. Bisher waren
hauptsächlich wasserlösliche Moleküle solchen Messungen zugänglich.
Bindungen zwischen amphiphilen Proteinen oder Membranproteinen zu
messen, die durch hydrophobe Wechselwirkungen in der Membran
verankert sind, erfordert neue Konzepte. Diesen Molekülen gilt das
Augenmerk dieser Arbeit. Da die Verankerung in sogenanten
„supported bi-layern“ und Vesikeln nicht immer zum gewünschten
Erfolg führt, wird hier eine ungewöhnliche, aber sehr natürliche
Alternative vorgestellt: Das Adhäsionsmolekül wird nicht aufwendig
isoliert und der Meßmethode zugänglich gemacht, sondern bleibt in
seiner natürlichen Umgebung, der Zelle, wohingegen die Methode
angepasst wird. Dies ist durch die Befestigung einer Zelle am
Kraftsensor eines Kraftspektroskopes geglückt und es gelang damit
erstmals die Adhäsionskraft eines einzelnen Adhäsionsmoleküls in
einer lebenden Zelle zu messen. So einfach diese Methode
beschrieben ist, so viele Unwägbarkeiten treten dabei durch die
hohe Komplexität der Zelle und der Zelloberfläche im Besonderen
auf. Daher wird einleitend eine grobe Einführung in die Funktionen
und den Aufbau einer Zelle und die üblichen Meßmethoden im Bereich
der Zelladhäsionsmessung vorgestellt. Die Beschreibung der
Meßmethode und der Umrüstung des Kraftmikroskopes zum
Zelladhäsionskraftspektroskop sind durch technische Details im
Anhang vervollständigt. Etwas aufwendig ist die Zusammenstellung
der Daten, Theorien und Annahmen zum Aufbau eines semi-empirischen
Modells zur Beschreibung der Adhäsionskraftmeßkurven beim Trennen
adhärierender Zellen, auf der Basis vieler unabhängiger
Einzelmolekülbindungen. Mit dem Zelladhäsionkraftspektroskop wurden
dafür die Youngs-Moduli und die viskoelastischen
Kelvin-Modell-Parameter verschiedener Zellen in dem eigens
entwickelten „visko-elastic-response-mode“ vermessen. Ebenso wurden
die Einflüsse der Zellkontaktkraft und der Kontaktzeit, sowie der
Zuggeschwindigkeit auf die Zelladhäsionsantwort studiert und in
Formeln gefaßt. Das Modell simuliert diese Meßdaten in guter
Übereinstimmung und gibt dadurch einen Einblick in die
physikalischen Randbedingungen für das einzelne Adhäsionsmolekül
während solcher Experimente unter Berücksichtigung des
zelltypischen Phänomens der Tetherbildung. Insbesondere kann damit
die Bindungsdichte bei Adhäsionen auf verschiedenen Oberflächen
berechnet werden. Demnach schließt eine Epithelzelle etwa vier
Bindungen pro Quadratmikrometer mit einer Glasoberfläche, zwei mit
einer anderen Epithelzelle und nur 0,8 mit einer passivierten
Oberfläche. Mit kraftspektroskopischen Messungen der
Adhäsionskräfte bei der Einnistung eines Trophoblasten in die
Gebärmutter an einem naturnahen Laborsystem kann eine andersartige
- mit dem Modell unabhängiger Bindungen nicht beschreibbare -
Wechselwirkung identifiziert werden. Die Meßergebnisse deuten auf
einen kooperativen Prozeß der molekularen Adhäsionsinselbildung
hin. Kontrollmessungen an funktionalisierten Oberflächen erhärten
diese Hypothese. Mit ersten Ergebnissen von Adhäsionsmessungen
zwischen Knochenzellen und potentiellen Implantatoberflächen wird
neben dem Einfluß der Oberflächenbeschaffenheit auch der des
Meßmediums nachweisbar, wodurch die Generalität dieser Methode
verdeutlicht wird. Im letzten Kapitel über die Interaktionen
einzelner Zellen wird anhand der induzierten Lektinwechselwirkung
zwischen roten Blutkörperchen die prinzipielle Möglichkeit der
Zelladhäsionskraftspektroskopie Einzelmolekülereignisse zu
vermessen nachgewiesen. Die dafür nötigen geringsten Kontaktkräfte
von unter 40 pN, konnten durch extrem weiche Kraftsensoren (