UV-B-Induzierte Genexpression bei der Buche Fagus sylvatica L.

Ziel dieser Arbeit war es, Veränderungen innerhalb weniger Stunden
nach UV-B-Exposition auf Protein- und Transkriptionsebene bei
10-wöchigen Buchensämlingen Fagus sylvatica L. zu analysieren. Dazu
wurden Buchensamen unter standardisierten Bedingungen angezogen und
von dem Zeitpunkt der Keimung an unter einem UV-B/PAR-Verhältnis
exponiert, das den natürlichen Umweltbedingungen sehr ähnlich ist.
Die UV-B-Exposition der 10-wöchigen Buchensämlinge erfolgte in
einer UV-B-Pflanzenkammer, die das Lichtspektrum des Sonnenlichts
simulierte. Die in einer Zeitkinetik geernteten Primärblätter
dienten als Ausgangsmaterial für die Daten in der vorliegenden
Arbeit. Die 2D-PAGE der löslichen Gesamtproteine und in vitro
translatierten Proteine wurde stets zweifach durchgeführt und
jeweils die Gele mit der besten Auflösung als Einzelbestimmung
ausgewertet. Die Untersuchungen auf Ebene des löslichen
Gesamtproteins der Buche Fagus sylvatica L. erfolgten mittels einer
Zeitkinetik über 1 Woche, wobei täglich 1 mal geerntet wurde. Die
2DPAGE Analyse ergab über die gesamte Zeitkinetik betrachtet 1
UV-B-induziertes Protein gegenüber der Starklicht-Kontrolle:
Protein 28 (17 kDa; pI 6,8). Die 2D-Analysen auf löslicher
Gesamtproteinebene stimmten mit den Daten auf in vitro
Translationsebene überein, wobei die Effekte auf
Transkriptionsebene wesentlich stärker waren. Insbesondere nach 3
und 6 h UV-B-Exposition konnten auf Transkriptebene eine 60%-ige
und 90%-ige Reprimierung gezeigt werden. Diese Reprimierung war
transient und auf Proteinebene in geringerem Ausmaß zeitlich
verzögert nachzuweisen. Diese Daten gaben Hinweise dafür, daß bei
der Buche Fagus sylvatica L. infolge UV-B-Exposition eine
Regulation auf Transkriptionsebene stattgefunden hat und die
drastische Reprimierung der Transkripte verschiedener Gene nur
transient war. Da diese Effekte auf Proteinebene wesentlich
schwächer waren, deutete das darauf hin, daß sich die
Buchensämlinge innerhalb weniger Stunden an die UV-B-Exposition
adaptierten. Auf in vitro Translationsebene gab es bei der Buche
Fagus sylvatica L. 18 mRNAs, die unter Berücksichtigung der UV-B-
und Starklicht-Tagesgänge direkt dem UV-B-Effekt zugeordnet werden
konnten. Es wurde belegt, daß infolge erhöhter UV-B-Exposition 10
Transkripte neu vorhanden waren und die Transkripte von 8 Proteinen
nicht mehr nachgewiesen werden konnten. Diesen charakteristischen
Veränderungen unterlagen überwiegend saure und basische Proteine.
Die Effekte waren zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kinetik zu
sehen (7 h, 10 h, 18 h, 28 h und 31 h nach Versuchsbeginn). Die
DDRT-PCR wurde eingesetzt, um UV-B-vermittelte Antworten auf
Genebene in Buchenblättern zu identifizieren. Bei den isolierten
cDNAs wurden geringe Homologien verschiedener Buchenklone in der
TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank gefunden: UV-Breprimierte
Buchenklone zeigten Ähnlichkeiten zur Peroxidase, zur „DNA directed
RNA-Polymerase alpha chain“ und zu einem „ara-3, ras-related
GTP-binding protein“. Durch UV-B-Exposition induzierte Buchenklone
wiesen Homologien zu dem „ABI-3“, zu dem „phytochrome regulated
gene“ und zur Squalen-Synthase auf. Die Sequenzen dieser
Buchenklone wurden zum ersten Mal beschrieben. Erstmals wurde ein
ribosomaler Klon L37 bei der Buche beschrieben. Die L37 mRNA wurde
aufgrund erhöhter UV-B-Exposition transient induziert. Bei erhöhter
Ozon-Behandlung erreichte das Transkript dieses Klons zwei zeitlich
voneinander getrennte Maxima; das zweite Maximum (am 3. Tag der
Behandlung, 1,6-fache Induktion) ging mit sichtbaren Ozon- Schäden
an den jungen Seitentrieben der Buche einher. Die Funktion dieses
Proteins ist bisher noch unbekannt. Für eine direkte Zuordnung der
isolierten Klone zu den Proteinspots auf der 2D-PAGE müßte eine
Sequenzierung der Proteinspots erfolgen. Die Menge der Proteinspots
für eine Proteinsequenzierung war jedoch nicht ausreichend. Über
die TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank wurde erstmalig ein
nach UV-BExposition induzierter Buchenklon isoliert, der hohe
Homologien zum „nascent polypeptide associated complex alpha chain“
aufwies. Dieses Transkript wurde bereits nach 3 h UV-BExposition
transient induziert. Der durch Ozon-Exposition reprimierende Effekt
wurde durch die kombinierte UV-B/Ozon-Exposition aufgehoben. Die
UV-B-vermittelte Induktion dieser zwei Buchenklone unterstützten
die auf der 2D-PAGE Analyse resultierende Hypothese, daß die
Regulation nach UV-B-Exposition vor allem auf Transkriptionsebene
stattzufinden scheint. Die Daten der vorliegenden Arbeit ergaben
folgende Schlußfolgerungen: Das Differentielle Display wurde
eingesetzt, um infolge UV-B-Exposition differentielle cDNAs in
Buchenblättern zu klonieren. Mittels der durchgeführten
Northern-Blots wurde gezeigt, daß die Veränderungen auf
Transkriptebene durch erhöhte UV-B-Exposition bedingt waren. Die
vorliegenden Daten belegten, daß 6 verschiedene Transkripte infolge
UV-B-Exposition transient induziert wurden. Diese überwiegenden
transienten Veränderungen wurden ebenso durch die Untersuchungen
mittels 2D-PAGE auf löslicher Gesamtprotein- und Transkriptebene
bestätigt. Das bedeutet, daß innerhalb kurzer Zeit eine Anpassung
der Buche an die veränderten Umweltbedingungen erfolgte.
Möglicherweise kann dies durch die Anzucht der Buchensämlinge unter
UV-B und Schwachlicht begründet werden. Diese Bedingungen sind
jedoch umweltrelevant, da die Pflanze in jungen Jahren unter
schattigen Lichtbedingungen heranwächst. In der vorliegenden Arbeit
wurden infolge abiotischer Streßbehandlung (erhöhtes UV-B) erstmals
2 eindeutig transient induzierte differentielle Buchenklone
isoliert: der ribosomale Klon L37 und der „nascent polypeptide
associated complex alpha chain“ Klon. Die durchgeführten
Northern-Blot Analysen zeigten, daß sich diese 2 Klone als
Kandidaten für Molekulare Marker zum Nachweis frühzeitiger
UV-B-vermittelter Änderungen auf Transkriptebene bei Fagus
sylvatica L. eignen.