Etablierung eines zellulären genetischen Screeningverfahrens zur Suche nach Regulatoren des Glucocorticoidrezeptors und Identifizierung von Cofilin 1 als Glucocorticoidrezeptor-Inhibitor

Glucocorticoidresistenz ist ein Phänomen, das bei vielen
Krankheiten eine wichtige Bedeutung hat. Insbesondere wird
vermutet, dass ihr eine kausale Rolle bei depressiven Erkrankungen
zukommt. In den meisten Fällen kommt die Resistenz durch eine
Fehlfunktion des Glucocorticoidrezeptors zustande. Deswegen ist es
von grossem Interesse, den Signalweg dieses Rezeptors im Detail zu
verstehen. In der Vergangenheit wurde viel zum Verständnis
beigetragen, unter anderem indem eine Reihe von GR-Regulatoren
identifiziert und deren Wirkungsmechanismus aufgeklärt wurde. Das
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Faktoren zu finden, die
in die GR-Signaltransduktion verwickelt sind. Dazu wurde ein
funktioneller Screen durchgeführt, der darauf beruhte,
GC-resistente Zellen herzustellen, diese mit responsiven Zellen zu
vergleichen und damit Kandidaten zu identifizieren, die
möglicherweise die GR-Funktion regulieren. Für die Herstellung
hormonresistenter Zellen wurde eine humane Zelllinie hergestellt,
die in Anwesenheit von Hormon nicht überleben kann; diese wurde
zufallsverteilt mutiert und in GC-haltigem Medium selektiert. Drei
hormonresistente Klone konnten die Selektion überleben, einer davon
wurde im Detail charakterisiert, dessen Proteinexpressionsmuster
mittels 2D-Gelektrophorese mit derjenigen der Ausgangszelllinie
verglichen und die unterschiedlich exprimierten Faktoren mittels
Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Dies führte zur
Identifikation von vier Kandidaten: Thioredoxin, hsp27,
Reticulocalbin und Cofilin 1, deren Wirkung auf den GR in
verschiedenen Zelllinien getestet wurde. Während die ersten drei
keinen Einfluss auf den GR hatten, konnte Cofilin als neuer
GR-Inhibitor etabliert werden. Cofilin ist gut untersucht als
Depolymerisierungsfaktor des Actin-Cytoskeletts, eine Rolle im
Signalweg des GRs oder eines anderen Transkriptionsfaktors war bis
jetzt jedoch nicht bekannt. Es zeigte sich, dass seine
inhibitorische Wirkung auf den GR von seiner Funktion in der
Actin-Regulation abhängig war, und ausserdem, dass Cofilin eine
Veränderung der intrazellulären Rezeptorverteilung vor Hormongabe
bewirkte. In nachfolgenden Experimenten wurde gefunden, dass sowohl
die chemische Zerstörung des Actin-Cytoskeletts wie auch die
direkte Erhöhung des Anteils an freiem Actin zur GR-Inhibierung und
veränderten Rezeptorverteilung führt. Des Weiteren wurde entdeckt,
dass erhöhte Mengen an freiem Actin den bekannten GR-Inhibitor
c-Jun induzieren, wodurch folgendes Modell aufgestellt wurde:
Cofilin erhöht durch seine Actin-Depolymerisierungsfunktion freies
Actin, damit wird über einen noch unbekannten Mechanismus c-Jun
induziert, welches wiederum den GR inhibiert. Damit wurde über
einen zellulären genetischen Screen Cofilin 1 als ein neuer
GR-Regulator identifiziert und nachfolgend der inhibierende
Wirkungsmechanismus von Cofilin aufgeklärt.