Analyse der Zellsortierung und Zellbewegung von Dictyostelium discoideum mittels konfokaler 4DMikroskopie

Methoden der multidimensionalen konfokalen Mikroskopie wurden für
die in vivo Beobachtung dynamischer Prozesse in der Amöbe
Dictyostelium discoideum verwendet. Um diese Vorgänge sichtbar zu
machen, wurde Grün Fluoreszierendes Protein (GFP) als Reporter von
Genexpression und als Fusionsprotein eingesetzt. Mit Hilfe von
4D-Mikroskopie und Mehrkanal-Detektion konnten dabei in vivo die
Zellsortierung in vielzelligen Aggregaten und die intrazelluläre
Lokalisierung des Zytoskelett-Proteins Severin visualisiert und
analysiert werden. Es wurde eine Methode entwickelt, spektral
unterschiedliche GFP-Varianten im Konfokalmikroskop simultan zu
detektieren und verläßlich zu trennen. Aufgrund der
Anregungswellenlänge und der Verwendung nur eines Aufnahmevorgangs
zur Erfassung beider GFP-Varianten eignet sich dieser Ansatz zur
schonenden Beobachtung lebender Zellen auch über längere Zeiträume.
Diese Eigenschaften ermöglichen darüber hinaus die Verwendung
dieser Konfiguration bei den wiederholten Aufnahmen einer
4D-Messung. In D. discoideum-Slugs wurde die Lokalisierung von
Prestalk-Zellen (pstA- und pst0-Zellen) während der Migration und
der Spitzenneubildung mit GFP als Reporter für spezifische
Genexpression untersucht. In migrierenden Slugs fallen
Prestalk-Zellen aus dem pstA-Bereich der Spitze in den
Prespore-Bereich zurück. Dieses Zurückfallen in der zentralen
Längsachse läßt sich durch die Organisation der Spitzenregion durch
cAMP-Spiralwellen mit einem Zentrum in der Längsachse erklären.
Prestalk-Zellen gelangen über diesen Weg aus der Spitze in den
Prespore-Bereich. An der Neubildung von Spitzen im Prespore-Bereich
sind ehemalige Prestalk-Zellen gemeinsam mit den
Anterior-like-Zellen des Prespore-Bereichs maßgeblich beteiligt.
Diese Zelltypen bewegen sich an die Slugoberseite und bilden dort
rotierende Zentren, aus denen sich neue Spitzen bilden. Das
Verhalten dieser Zellgruppen und die 4DTrajektorien einzelner
Zellen deuten auf eine Organisation dieser Zentren durch
cAMPSignale. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß es innerhalb
dieser Zellen Gruppen gibt, die zu unterschiedlichen Zeiten in neue
Spitzen rekrutiert werden. PstA-Zellen sind in neuen Spitzen wieder
im vordersten Bereich lokalisiert, obwohl sie aus dem
Prespore-Bereich kommen, während pst0-Zellen im gesamten
Prestalk-Bereich zu finden sind. Artspezifische
Zellsortierungsprozesse gemeinsam vorkommender Dictyostelium-Arten
wurden mittels der Markierung von Zellen der beteiligten Arten
untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß die Sortierung von D.
discoideum/D. mucoroides-Mischungen schon in den
Aggregationsströmen anfängt und im Mound abgeschlossen wird. Die
Trennung erfolgt über Unterschiede in der Zelladhäsion. Erheblich
beschleunigt wird dieser Sortierungsvorgang durch die gerichtete
chemotaktische Bewegung beider Arten auf dieselben Signale, die bei
den sich in den Zellströmen schneller bewegenden D.
mucoroides-Zellen zu einer Anreicherung im Moundzentrum führt.
Somit sind in vivo zwei Faktoren gemeinsam für die artspezifische
Sortierung von D. discoideum und D. mucoroides verantwortlich. In
Mischungen von D. discoideum und Polysphondylium spec. geschieht
die Aussortierung über die Nutzung unterschiedlicher Botenstoffe
für die Chemotaxis, so daß die Arten getrennt aggregieren. Es
konnte gezeigt werden, daß diese getrennte Aggregation sehr
spezifisch ist und es dennoch zu einer Interaktion zwischen D.
discoideum und fortgeschrittenen Polysphondylium-Aggregaten kommt,
da in Polysphondylium in späten Aggregationsphasen cAMP für die
interzelluläre Kommunikation verwendet wird. In dieser Phase wird
von Polysphondylium sowohl cAMP als auch Glorin sekretiert. Severin
ist ein mit Gelsolin verwandtes 40 kDa Protein, das
F-Aktin-Filamente fragmentiert und an das (+)-Ende des entstehenden
Fragments bindet. Mit Hilfe eines GFP-Fusionsproteins wurde die
intrazelluläre Lokalisierung dieses Proteins in vivo während einer
Vielzahl zellulärer Aktivitäten untersucht. Severin ist in den
aktiven Bereichen des F-Aktin Zellkortex angereichert. Obwohl die
Morphologie von D. discoideum-Zellen in den verschiedenen Phasen
der Entwicklung sehr unterschiedlich ist, ist die Lokalisierung von
Severin in allen Stadien primär von der Bildung neuer Zellfortsätze
trennbar. Die Anreicherung von Severin ist hingegen mit der
Bewegung der Zelle in diese neu gebildeten Fortsätze assoziiert.
Erstmals wurde im Rahmen dieser Arbeit der Effekt von cAMP-Signalen
auf das Zytoskelett einzelner Zellen in Aggregationsströmen
ausführlich dargestellt.