Etablierung und Anwendung von Hochdurchsatz-Verfahren zur Identifizierung strahleninduzierbarer Gene in der Hefe

Die Microarray-Technik stellt eine sehr neue Technologie dar, die
zwei wesentliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken
besitzt. Zum einen ist durch Fluoreszenzmarkierung eine kompetitive
Hybridisierung möglich, so daß die behandelte Probe und die
zugehörige Kontrolle in einem Experiment unter exakt gleichen
Bedingungen untersucht werden können. Der noch größere Vorteil
dieser Technik liegt in der Möglichkeit, die Expression mehrerer
tausend Gene gleichzeitig untersuchen zu können. In diesem Kapitel
wurde der Einfluß verschiedener Strahlenarten (UV-C, γ-, Protonen-
und C6+-Ionen-Strahlung) auf die Expression von Hefegenen getestet.
In einem ersten Schritt wurden für die verschiedenen Noxen die
äquitoxischen Dosen ermittelt, um die Strahlenarten miteinander
vergleichen zu können. Als Kontrolle wurde zusätzlich zu den
verwendeten Strahlenarten der Einfluß der alkylierenden Chemikalie
MMS auf die Expression untersucht. Hierzu liegt bereits eine
publizierte Arbeit vor (Jelinsky and Samson, 1999), mit der die
hier erzielten Ergebnisse verglichen werden konnten. Fünf der zehn
am stärksten induzierten Gene wurden bereits von Jelinsky und
Samson als stark induzierbar (Faktor >10) beschrieben. Die
Diskrepanz bei den fünf restlichen Genen könnte trotz weitgehender
Adaption des „Jelinsky“- Protokolls durch die Verwendung eines
anderen Stammes oder durch die unterschiedliche Microarray Technik
(hier cDNA-Arrays, bei Jelinsky und Samson Oligonukleotid-Arrays)
erklärbar sein. Eine Wiederholung der Hybridisierung ergab, daß die
Expressionsunterschiede von den zehn am stärksten induzierten Genen
im ersten Experiment im Wiederholungsexperiment in neun Fällen
bestätigt werden konnten. Interessanterweise ließen sich sieben
dieser Gene in drei Gruppen einordnen, die räumlich auf dem
Chromosom direkt benachbart angeordnet sind und vermutlich
koreguliert werden. Während bei MMS-behandelten Zellen die
stärksten Expressionsunterschiede beobachtet wurden, zeigten
sämtliche verwendete ionisierende Strahlenarten einen geringen
Effekt auf das Expressionsprofil. UV-Strahlung bewirkte ein
intermediäres Expressionsmuster bezüglich der Transkriptmengen - es
waren deutlich mehr Gene induziert bzw. reprimiert als bei den
ionisierenden Strahlenarten, wohingegen im Vergleich zur
MMS-Behandlung signifikant weniger Expressionsveränderungen
festgestellt wurden. Die Analyse der Gene mit stark veränderten
Transkriptmengen ergab, daß viele Gene, deren Induktion nach
Bestrahlung bereits früher publiziert worden ist, hier nicht als
induzierbar gefunden wurden. Mehrere Faktoren könnten dafür
verantwortlich sein: Niedrig exprimierte Gene (viele der
DNAReparaturgene sind niedrig exprimiert!) sind wie bei vielen
anderen Methoden der Expressionsmessung schwer detektierbar. Zudem
können geringe Expressionsunterschiede (kleiner Faktor zwei)
bislang nicht festgestellt werden. Ferner konnten aufgrund des
zeitlichen Rahmens meines Aufenthalts am NIEHS alle
Hybridisierungen nur einmal (bei γ-Strahlung zweimal) wiederholt
werden, wodurch eine statistisch verläßliche Aussage im Fall von
geringen Expressionsunterschieden erschwert ist. Daher wurden in
diesem Kapitel nur Expressionsunterschiede von mindestens Faktor
zwei berücksichtigt. Trotz dieser Schwierigkeiten gibt es einige
Indizien, die für eine biologische Relevanz der gezeigten
Ergebnisse sprechen. So wurden in mehreren Fällen Genpaare (bzw.
-gruppen) identifiziert, deren Transkriptmengen nach Bestrahlung
ähnlich stark verändert vorlagen und die bereits früher aufgrund
funktioneller Ähnlichkeiten in Genfamilien zusammengefasst wurden
(z.B. wurden fünf ribosomale Gene mit mehr als dreifach erhöhter
Transkriptmenge nach UV-Bestrahlung gefunden). Außerdem wurden die
RNR-Gene bei allen getesteten Strahlenarten als stark induzierbar
eingestuft, was aus früheren Expressionsmessungen bereits bekannt
ist (Endo-Ichikawa, et al., 1996; Huang and Elledge, 1997; Hurd and
Roberts, 1989). Nach UV- und C6+-Ionen - Bestrahlung konnten zudem
mit DUN1 und RAD53 zwei Gene als induzierbar eingestuft werden, die
an der Signaltransduktion, die zur Induktion der RNR-Gene notwendig
ist, beteiligt sind. Schließlich zeigte auch die stichprobenartige
Überprüfung der mit Microarrays erzielten Expressionsdaten durch
Northern-Hybridisierungen eine gute Übereinstimmung. So konnten die
in den drei untersuchten Genen (EGT2, HSP30 und YPR015C) gefundenen
Transkriptionsveränderungen nach Bestrahlung bzw. Behandlung mit
MMS verifiziert werden. Neben den Genen mit bekannter Funktion in
der DNA-Schadensprozessierung wurden einige Gene identifiziert, die
bislang nicht in Verbindung mit DNA-Schädigung gebracht worden
sind. So zeigte sich nach Behandlung mit allen untersuchten
Strahlenarten (auch MMS) eine deutliche Verringerung der
Transkriptmenge des EGT2-Gens, für das eine Rolle in der
Zellzykluskontrolle gezeigt wurde (Kovacech, et al., 1996). Eine
erhöhte Transkriptmenge wurde für den Leserahmen YLL030C nach
UV-,C6+- und γ-Bestrahlung gefunden. Bei sämtlichen verwendeten
Strahlenarten wurde eine ebenfalls deutlich erhöhte Transkriptmenge
für den Leserahmen YPR015C gezeigt, der aufgrund von
Sequenzhomologien als möglicher Transkriptionsfaktor diskutiert
wird (Bohm, et al., 1997). Inwieweit Gene, die lediglich bei einer
Bestrahlungsart induziert bzw. reprimiert vorlagen, tatsächlich
strahlenspezifisch reguliert sind, muß erst durch weitergehende
Analysen geklärt werden.