Studien zur zellbiologischen Funktion des „Progressions-assoziierten Proteins“ (PAP) und dessen Bedeutung für die Invasivität von Mammakarzinomzellen

Die Identifizierung von Genen, deren Expression Einfluß auf die
Metastasierung von Tumoren nimmt, stellt eine Möglichkeit zur
Verbesserung sowohl diagnostischer als auch therapeutischer Ansätze
in der Behandlung von Krebs dar. Jede achte Frau in westlichen
Industrienationen erkrankt an Brustkrebs, wobei die Entwicklung
neuer Methoden zur frühzeitigen Erkennung von Metastasen und deren
zielgerichtete Behandlung entscheidend ist, um eine Therapie von
Patientinnen mit progressivem Mammakarzinom zu ermöglichen.
Entwickelt sich eine Zelle eines Primärtumors zu einer invasiven
metastasierungsfähigen Zelle, so ist für diese Veränderung des
Phänotyps eine grundlegende Modifizierung in der Expression
zahlreicher Gene zu erwarten. In einem zellulären Modellsystem für
die Progression des Mammakarzinoms wurde in der invasiven Zellinie
MCF-7ADR das „Progressions-assoziierte Protein“ (PAP)
identifiziert, in der nicht-invasiven Zellinie MCF-7 konnte dagegen
keine Expression nachgewiesen werden. Die Aufgabenstellung dieser
Arbeit ist die Klärung der Bedeutung der Expression dieses Gens für
die Veränderung einer Zelle von einem nicht invasiven hin zu einem
invasiven Phänotyp. PAP stellt ein Protein mit 157 Aminosäuren dar
und gehört zur PMP22-Genfamilie, deren Mitglieder putative
Viertransmembran-Rezeptoren sind. Neben der Hypothese der
Einflußnahme von PAP auf die Metastasierungsfähigkeit einer Zelle
werden für die Homologen eine Vielzahl zellulärer Funktionen
postuliert, wie z.B. die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten,
Adhäsionsvermittlung, Zellzyklusregulation, Tumorgenese und
Apoptose. Die in dieser Arbeit durchgeführten Expressionsstudien
zeigten, daß PAP in einer Vielzahl von Normalgeweben exprimiert
wird, mit Ausnahme von Geweben des Zentralen Nervensystems (ZNS)
und peripherer Blutlymphozyten. Erste vergleichende
Prävalenzstudien mittels Northern-Blot- Analysen zwischen Tumor-
und Normalgewebe einzelner Patienten wiesen im Fall von
Gewebeproben aus Organen des Zentralnervensystems eine positive
Korrelation der PAP-Expression mit den Tumorproben auf. Eine
Untersuchung von Mammakarzinom-Zellinien mit unterschiedlichem
Metastasierungsgrad in der Nacktmaus belegte, daß PAP lediglich in
den als metastasierend eingestuften Zellen exprimiert wurde. Über
gekoppelte in vitro Transkription/Translation konnte gezeigt
werden, daß die in einen Expressionsvektor klonierte PAP-cDNS für
ein Protein mit einer Größe von etwa 18 kDa kodierte. Auch mittels
Immunfluoreszenzstudien transient transfizierter COS-7-Zellen
konnte die Expression eines Epitop-markierten Proteins und die
Lokalisierung an der Zellmembran nachgewiesen werden. PAP
exprimierende Zellen waren nicht apoptotisch, jedoch oft auffallend
abgerundet. Einzelne Klone stabil transfizierter MCF-7-Zellen, die
PAP konstitutiv exprimierten, zeigten kein anderes
Wachstumsverhalten in Proliferationstests gegenüber der
untransfizierten oder den mocktransfizierten MCF-7-Zellen. Auch ihr
Verhalten in in-vitro-Invasionstests unterschied sich nicht von dem
der Ursprungszellen, während MCF-7ADR hier starke Invasivität
aufwies. Eine endgültige Aussage über eine Funktion von PAP bei der
Invasion von Tumoren kann jedoch erst nach der Auswertung von
Experimenten in Nacktmäusen gemacht werden. Durch Serumentzug
wachstumsarretierte humane Primärzellen zeigten für PAP eine
inverse Regulation im Vergleich zu dem homologen Protein PMP22. PAP
wurde in proliferierenden Zellen stärker exprimiert als in
arretierten, während für PMP22 ein Anstieg der RNS in arretierten
Zellen zu beobachteten war. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen,
daß alleine die Expression von PAP nicht ausreicht, um MCF-7-
Zellen in vitro zur Invasion zu befähigen. Dafür könnten allerdings
sowohl extrazelluläre Stimuli, als auch intrazelluläre
Interaktionspartner fehlen, die zur Änderung des Phänotyps der
Zellen und zur Invasion notwendig sein könnten. Da Rezeptoren
jedoch in allen Schritten der Metastasierung von grundlegender
Bedeutung sind, kann auch für PAP nicht ausgeschlossen werden, daß
es in diesen komplexen zellulären Mechanismen eine Rolle spielt.
Ein Einfluß auf die Proliferationsfähigkeit von Zellen konnte durch
die konstitutive Expression von PAP nicht nachgewiesen werden.
Eindeutig belegt werden konnte aber eine Korrelation mit dem
Zellzyklus. Durch Serumentzug arretierte primäre Zellen zeigten
eine verminderte PAP-Expression im Vergleich zu proliferierenden
Zellen. Die Überexpression von PAP in COS-7-Zellen läßt allerdings
die Vermutung zu, daß PAP, ebenso wie das homologe PMP22, einen
Einfluß auf die Zellmorphologie und auf die Adhäsion von Zellen
haben könnte. PAP könnte dabei in einen Adhäsion-regulierenden
Mechanismus eingebunden sein, der bei einer Überexpression von PAP
zu einem Abrunden der Zellen und einem Substratkontaktverlust
führen könnte. Unter physiologischen Bedingungen könnte dies für
das Loslösen der Zellen während der G2-Phase des Zellzyklus
notwendig sein. Bei einer fehlerhaften Regulation (einer
gesteigerten Expression von PAP) unter pathologischen Bedingungen
könnte eine leichtere Loslösung von Tumorzellen die Metastasierung
begünstigen. Denkbar wäre eine Interaktion von PAP mit Integrin-
Rezeptoren, wodurch die Affinität des Integrins beeinflußt werden
könnte. Diese Hypothese bietet einen Ansatzpunkt für weitere
Studien bezüglich des Einflusses von PAP auf zelluläre Vorgänge,
wie Zellzyklus-Regulation und Zellwanderung.