Proteomanalysen an Halobacterium salinarum

Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Proteome von H.
salinarum untersucht, die nach zellulären Kompartimenten
unterschieden wurden in (1) das Flagellarmotor-Proteom (2) das
Cytosolproteom und (3) das Membranproteom. Die Untersuchung des
Flagellarmotors erfolgte hauptsächlich auf struktureller Basis
mittels Elektronenmikroskopie. Es konnte eine Struktur mit zwei
übereinanderliegenden Ringen isoliert werden, die beide an eine
Flagelle gebunden sind. Aus weiteren Aufnahmen und
Größenkorrelationen wurde ein Modell zum Flagellarmotor entworfen,
welches eine Rotation beider Ringe beinhaltet. An diese
Doppelringstruktur sind mehrere Flagellen über einen Hook gebunden,
was dieses Modell damit vom bakteriellen Flagellarmotor
unterscheidet. Bei der Untersuchung des Cytosolproteoms konnten
insgesamt 840 Proteine mittels MALDI-MS-Fingerprint identifiziert
werden, was einer Identifizierungsrate von 38% des löslichen
Proteoms entspricht (Identifizierungsrate aller löslichen Proteine
größer 20 kD: 61%). Es wurde eine massenkompatible Silberfärbung
optimiert und ein semi-manuelles Verfahren zur in-Gel Spaltung
entwickelt, mit dem 800 Proteine/Tag enzymatisch gespalten werden
können. Für die anschließende Identifizierung wurde ein
Standardprotokoll für die Proben- und Matrixpräparation entwickelt,
welches sich im Vergleich zu anderen automatischen Präparationen
als zuverlässiger und sensitiver gezeigt hat. Im Verlauf dieser
Arbeit wurde von der Bioinformatikgruppe (Dr. F. Pfeiffer) das
web-basierte HALOLEX-System entwickelt, welches als Ziel die
vollständige Erfassung aller Fakten zu H. salinarum hat. Die
generierten Daten (Gele, Proteinidentifizierungen, MALDI-Peaks,
MS/MS-Peaks) werden innerhalb dieser Oberfläche zugänglich gemacht
und erlauben detaillierte Nachanalysen. Für das Membranproteom
wurde gezeigt, dass der etablierte Zellaufschluss mittels
Niedrigsalz-Dialyse zu einer erheblichen Kontamination mit
löslichen Proteinen führt. Ein Aufschluss unter Hochsalzbedingungen
mit anschließender Dichtegradienten-Zentrifugation reinigt die
Membran, jedoch dissoziiert die Zellmembran bei anschließender
Niedrigsalz-Behandlung in hohem Maße in nicht pelletierbare
Fragmente. Eine optimierte Membranaufarbeitung unter ständigen
Hochsalzbedingungen, Dichtegradienten-Zentrifugation, Delipidierung
und Solubilisierung in einer Detergenzienmischung (Triton
X-100/ASB-14) führte bei anschließender zweidimensionaler Trennung
(IEF/SDS) zur Identifizierung von fast ausschließlich peripheren
Membranproteinen. Mit einer fluoreszenzmarkierten Membranfraktion
konnte gezeigt werden, dass der Verlust von integralen
Membranproteinen auf einer nahezu quantitativen Präzipitation der
Membranproteine an derem pI beruht. Eine pI-unabhängige Strategie
wurde mittels BAC/SDS etabliert, die speziell bei H. salinarum zu
einer guten Proteinauftrennung führt. Die Identifizierung eines 13
TM-Antiporters (0,22 TM/kD, GRAVY +0,74) als dominantestes Protein
dieser Membranfraktion zeigt die Anwendbarkeit dieses Systems. In
einem Vergleich von Membranfraktionen aus aerob und phototroph
gewachsenen Kulturen konnten so Unterschiede des Expressionsniveaus
von Membranproteinen nachgewiesen werden. Aus theoretischen
Berechnungen der vorhergesagten Membranproteine zeigte sich
weiterhin, dass bei tryptischer Spaltung nicht ausreichend
Peptid-Fragmente generiert werden, um mittels
MALDI-Fingerprint-Analyse identifiziert zu werden. Diese (H.
salinarum spezifische) Problematik kann mittels MS/MS umgangen
werden. Bei der Kombination aus 1-D Gel und LC/MS/MS konnten
schließlich 114 integrale Membranproteine identifiziert werden, was
20% des integralen Membranproteoms entspricht.