NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR)

1. Es wurde eine Methode entwickelt, die POR nach der
Solubilisierung aus Etioplasten chromatographisch zur Homogenität
zu reinigen. Die spezifische Aktivität konnte gegenüber der POR in
Etioplasten annähernd um das 14-fache gesteigert werden. Dabei
wurden alle endogenen Pigmente und Lipide abgetrennt. So konnte
erstmals überzeugend mit isolierter POR aus Pflanzen gezeigt
werden, daß eine Bindung an das Substrat oder das Vorhandensein
einer Membranumgebung keine Voraussetzung für den Erhalt der
Aktivität darstellt. 2. Mittels detaillierter Pigment- und
Proteinanalysen, inklusive densitometrischer Verfahren, konnte
nachgewiesen werden, daß in Etioplasten ein Molekül Pchlide a an
ein Molekül POR gebunden ist. 3. Substratspezifitätsstudien mit
Substratanalogen zu Pchlide a zeigten, daß strukturelle
Veränderungen an den Seitenketten des Porphyrinringes A und B,
nicht aber Modifikationen am Ring D oder am isozyklischen Ring E,
von der POR akzeptiert werden und zu photokonvertierbaren
Substraten führen. Die Ergebnisse dieser Versuche lieferten ein
neues Modell zu dem Mechanismus der Katalyse. Demzufolge sind die
Ringe D und E am Boden der Enzymtasche fixiert und eine
Enolatbildung an der Carbonylgruppe des Ringes E an der die
Reaktion beteiligt. Die Ringe A und B liegen mehr oder weniger
außerhalb der Enzymtasche. Erstmals konnte die
Photokonvertierbarkeit von Pchlide b, Zn-[3-acetyl]-Protopheide a
und Zn-[3-formyl]-Protopheide a gezeigt werden. 4. Kinetische
Untersuchungen mit den Substratanalogen stellten die Auswirkungen
der verschiedenen Seitenkettenmodifikationen auf die
Reaktionsgeschwindigkeit heraus. Die Pigmente ließen sich in drei
Gruppen mit einer „schnellen“ (z. B. Pchlide a), einer
„mittelschnellen“ (z. B. [8-Vinyl]-Pchlide a) und einer „langsamen“
(z. B. Zn-71-OH-Protopheide a) Reaktionsgeschwindigkeit einteilen.
Ein komplementärer Zusammenhang zwischen Fluoreszenz- und
Photoreaktion-Quantenausbeute konnte nicht festgestellt werden. 5.
Über die Bestimmung der KM-Werte für Pchlide a und Pchlide b (0,47
µM, respektive 0,63 µM) wurde demonstriert daß die Affinität beider
Pigmente zu der PORA aus Hafer annähernd gleich groß ist.
Chlorophyll c1 konnte als kompetetiver Hemmstoff für die POR
identifiziert werden. 6. Bei der Photoreduktion tritt
Substrathemmung auf. Dies konnte bei einem Überschuß an Pchlide a
oder Pchlide b gegenüber der POR (> 1 mol Substrat/1 mol POR)
gezeigt werden. 7. An solubilisierten Etioplastenmembranen und an
solubilisierter, weitgehend aufgereinigter POR konnten die
unterschiedlichen spektralen in vivo-Formen des photoaktiven
endogenen Pchlide a dargestellt werden. Die nach der Photoreduktion
auftretende spektrale Verschiebung des Chlide a (von A680 nm nach
A672 nm), die mit dem in vivo auftretenden Shibata-Shift
vergleichbar ist, konnte in diesen Proben gezeigt werden. Die in
der Literatur postulierte Ursache des Shibata-Shift`s, eine
Freisetzung des Chlide a aus den ternären Komplexen
(POR-NADPH-Chlide a), kann anhand der hier erzielten Ergebnisse
bestätigt werden. 8. Es wurde eine Methode entwickelt, mit deren
Hilfe an solubilisierter und zur Homogenität gereinigter POR
erstmals der Einfluß von Lipiden auf den spektralen Verlauf der
Photoreduktion gezeigt werden kann. Nach der Dialyse einer Mischung
von Einzelkomponenten (gereinigte POR, NADPH,
MGDG/DGDG/Zn-Protopheide a-Gemisch) gegen 80 % Glycerin konnte die
Photoumwandlung langwellig-absorbierender ternärer Komplexe, sowie
die mit dem Shibata-Shift vergleichbare Verschiebung des Produktes
in vitro dargestellt werden. 9. Die Ergebnisse dieser
Rekonstitutionsversuche weisen darauf hin, daß in vivo die
Einbettung der ternären Komplexe in die spezielle Lipidumgebung der
Prolamellarkörper für die Bildung von unterschiedlich
absorbierenden spektralen Formen des photoaktiven Pchlide a
verantwortlich sind.