Untersuchungen zur Translokation und Insertion mitochondrialer Proteine über den Tim17-Tim23-Komplex

Die Biogenese von Mitochondrien erfordert den Import von
Präproteinen aus dem Cytosol in die mitochondrialen
Subkompartimente. Der TIM23-Komplex der mitochondrialen
Innenmembran ist für die Translokation von Präproteinen über die
Innenmembran verantwortlich und vermittelt darüber hinaus die
Insertion von Proteinen in die Innenmembran. Tim23 weist zwei
funktionell unterscheidbare Domänen auf: Eine N-terminale
hydrophile Rezeptordomäne im Intermembranraum und einen hydrophoben
C-terminalen Bereich. Das phylogenetisch verwandte Tim17 ist ein
sehr hydrophobes Protein, welches vier Transmembrandomänen
ausbildet, die von zwei kurzen Enden im Intermembranraum flankiert
werden. Die hydrophoben Bereiche von Tim17 und Tim23 bilden
vermutlich den kanalbildenden Teil der Translokase. In der
vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von Tim17 bei der
Translokation von Präproteinen über die Innenmembran untersucht. Es
konnte eine kurze N-terminale Sequenz von 11 Aminosäureresten
identifiziert werden, welche für die Funktionalität der
TIM23-Translokase essentiell ist. Die Deletion dieser Sequenz
beeinflusst die Integrität der bekannten Untereinheiten der
TIM23-Translokase nicht, führt jedoch zu einer starken
Beeinträchtigung der Translokation von Präproteinen über die
mitochondriale Innenmembran. Durch gezielte Alanin-Punktmutagenese
konnten zwei konservierte Aspartatreste in der Tim17-Sequenz
identifiziert werden, welche für den Translokationsdefekt
verantwortlich sind. Die Analyse weiterer Mutanten in Tim17 mit
einzelnen oder wechselseitig ausgetauschten geladenen
Aminosäureresten im Intermembranraum legen nahe, dass die
konservierten negativen Ladungen in Tim17 mit den positiv geladenen
Präsequenzen interagieren und dadurch die Translokation von
Präproteinen durch den TIM23-Komplex regulieren. Diese Ergebnisse
geben einen Einblick in eine Präprotein-abhängige Regulation der
TIM23-Translokase über ein mögliches "Öffnen" und "Schließen" des
Translokationskanals via Tim17. Die meisten Proteine der
mitochondrialen Innenmembran, die als Präproteine mit
mitochondrialen Präsequenzen im Cytosol synthetisiert werden,
erreichen die Innenmembran auf einem von zwei alternativen
Sortierungswegen: Dem "Stop-Transfer-Weg", auf dem Präproteine
während der Translokation durch den TIM23-Komplex arretiert und
lateral in die Innenmembran inseriert werden und dem Weg der
"Konservativen Sortierung", auf dem die Proteine über Intermediate
in der mitochondrialen Matrix in die Innenmembran inseriert werden.
Folglich müssen diese Proteine entsprechende Sortierungssignale
aufweisen, die entweder die laterale Membraninsertion
(Stop-Transfer-Proteine) oder die die Translokation in die Matrix
(konservativ sortierte Proteine) durch die TIM23-Translokase
vermitteln. Das Sortierungsverhalten von mitochondrialen
Innenmembranproteinen mit N-terminalen Präsequenzen, die zunächst
für die initiale Translokation des N-Terminus der Proteine sorgen,
wird von den Transmembrandomänen bestimmt. Um den Einfluss der
Transmembrandomänen auf den Sortierungsweg zu untersuchen, wurden
die entsprechenden Domänen von Stop-Transfer sortierten Proteinen
und konservativ sortierten Proteinen wechselseitig ausgetauscht. In
den chimären Proteinen bestimmten jeweils die eingeführten
Transmembrandomänen das Sortierungsverhalten. Eine Untersuchung
dieser Transmembrandomänen zeigte zwei systematische Unterschiede:
Transmembrandomänen, die die konservative Sortierung vermitteln,
weisen eine zumeist moderate Hydrophobizität auf und enthalten
zumeist Prolinreste. Dagegen sind Stop-Transfer vermittelnde
Transmembrandomänen typischerweise stärker hydrophob und frei von
Prolinresten. Die Einführung von Prolinresten in die
Transmembrandomänen von ursprünglich Stop-Transfer sortierten
Proteinen führte zu deren Translokation in die Matrix. Umgekehrt
führte die Mutagenese von Prolinresten in Transmembrandomänen
ursprünglich konservativ sortierter Proteine zu deren Arretierung
in der Innenmembran. Die Anwesenheit von Prolinresten in den
Transmembrandomänen bestimmt demnach den Sortierungsweg dieser
Innenmembranproteine. Zukünftige Studien werden zeigen, wie diese
Sortierungssignale, welche eventuell eine von Prolinresten
gebrochene hydrophobe Helix darstellen, von der TIM23-Translokase
erkannt und entsprechend umgesetzt werden. Die Bedeutung von
Prolinresten in Transmembrandomänen von konservativ sortierten
Proteinen konnte durch Mutagenese sowohl in vitro als auch in vivo
gezeigt werden. Diese Erkenntnis sollte sowohl in Vorhersagen von
Proteinsortierungswegen als auch bei der zukünftigen Entwicklung
mitochondrialer Proteine für gentherapeutische Ansätze zur
Behandlung mitochondrialer Erkrankungen berücksichtigt werden.